哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール
Summary
CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。
Abstract
CRISPR-Casシステムを用いてゲノム編集を行い、様々な生物のゲノムを精密に編集する能力を大幅に向上させています。哺乳類細胞の文脈では、この技術は、機能的ゲノミクス研究のためのゲノム全体の遺伝的スクリーンを実行するための新しい手段を表す。すべての開いた読み取りフレームを標的とするガイドRNA(sgRNA)のライブラリは、遺伝子機能および細胞プロセスを含む特定の表現型をスクリーニングすることができる細胞の単一プール内の何千もの遺伝的摂動の顔の生成を可能にする公平で体系的な方法。CRISPR-Casスクリーンは、細胞の型示体の遺伝的青写真を明らかにするために、簡単で効率的で安価な方法を研究者に提供します。さらに、様々な細胞株や異なるがんタイプから行われるスクリーンの微分解析により、腫瘍細胞に文脈的に不可欠な遺伝子を同定し、特定の抗癌治療の潜在的な標的を明らかにすることができます。ヒト細胞でゲノム全体のスクリーンを実行することは、数千万個の細胞の処理を伴い、大規模なデータセットの分析を必要とするので、困難な場合があります。セルラインの特性認識、CRISPR ライブラリの考慮事項、解析中の CRISPR テクノロジの制限と機能の理解など、これらの画面の詳細は見落とされることがよくあります。ここでは、プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9ベースの画面の正常なパフォーマンスのための詳細なプロトコルを提供します。
Introduction
CRISPR-Casは、クラスター化された定期的に間隔をあけた短いパリンドロミックリピートおよびCRISPR関連ヌクレアーゼの略で、合成ガイドRNA(sgRNA)と複合体内の単一のヌクレアーゼタンパク質(例えば、Cas9)から構成される。このリボヌクレオタンパク質複合体は、Cas9酵素を標的とし、特定のゲノム遺伝子座1で二本鎖DNA破断を誘導する。二本鎖の切断は、相同性指向修復(HDR)を介して修復することができ、より一般的には、非相同エンド結合(NHEJ)を介して、遺伝子機能を頻繁に破壊する挿入および/または欠失(INDELS)をもたらすエラーが発生しやすい修復メカニズム1.CRISPRの効率性とシンプルさは、以前のゲノム編集技術(すなわち、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZNF)または転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ()をはるかに上回る、これまで達成不可能なレベルのゲノムターゲティングを可能にします。TALENS)は、いずれも設計の複雑さの増大、トランスフェクション効率の低下、多重遺伝子編集2の限界に苦しんでいる。
CRISPRシングルガイドRNAベースのゲノム編集の基礎研究アプリケーションは、科学者が効率的かつ安価に個々の遺伝子の機能と遺伝的相互作用ネットワークのトポロジーを問うことを可能にしました。機能的ゲノムワイドスクリーンを実行する能力は、特にRNA干渉(RNAi)や遺伝子トラップ変異などの以前の遺伝的摂動技術と比較した場合、CRISPR-Casシステムの使用によって大幅に強化されました。特に、RNAiは高いオフターゲット効果と不完全なノックダウンに苦しんでおり、CRISPR3、4、5に比べて感度と特異性が低く、遺伝子トラップ法はハプロイドでのみ実現可能です。機能喪失画面のセルは、尋問可能なセルモデルの範囲を制限する 6.完全な遺伝子ノックアウトを生成するCRISPRの能力は、低ノイズ、最小限のオフターゲット効果と試薬5全体の一貫した活性で、変異型の現象型を調知するためのより生物学的に堅牢なシステムを提供します。ヒトゲノム全体を標的とするCRISPR-Cas9 sgRNAライブラリーが広く利用可能となり、1回の実験で何千もの遺伝子ノックアウトを同時に生成できる3、7、8、9.
トロントノックアウト(TKO)ライブラリー(Addgeneを通じて入手可能)と呼ばれる独自のCRISPR-Cas9ゲノムワイドsgRNAレンチウイルスライブラリを開発し、高解像度機能ゲノミクススクリーンを容易にするためにコンパクトでシーケンス最適化されています。最新のライブラリTKOv3は、経験データ10を使用して効率を編集するために最適化された71,090ガイドを持つ〜18,000人のヒトタンパク質コード遺伝子を対象としています。さらに、TKOv3は、単一のベクター上でCas9およびsgRNAを発現する1成分ライブラリ(LCV2:TKOv3、Addgene ID#90294)として利用可能であり、安定したCas9発現細胞を生成する必要性を緩和し、幅広いゲノムワイドノックアウトを可能にする。哺乳類細胞型。TKOv3は、Cas9(pLCKO2::TKOv3、アディジーンID#125517)を持たないベクターでも利用可能であり、Cas911を発現する細胞で利用することができる。
ゲノム全体のCRISPR-Cas9編集細胞集団は、次世代シーケンシングによって時間の経過とともに定量化されたsgRNAの豊富さと異なる増殖条件にさらされる可能性があります。摂 動。CRISPRノックアウトライブラリーは、摂動時に細胞フィットネス欠陥を引き起こし、中程度の薬物感受性(例えば、感受性または耐性遺伝子)、タンパク質発現を調節する(例えば、レポーター)、または特定の遺伝子を同定するために利用することができる。経路機能および細胞状態12、13、14。例えば、癌細胞株における差動適合性スクリーンは、腫瘍遺伝子および濃縮の枯渇または減少または腫瘍抑制遺伝子3、14、15の増加の両方を同定することができる。同様に、治療薬の中間用量を使用すると、薬剤耐性および感量遺伝子16、17の両方を明らかにすることができる。
ここでは、ライブラリー生成からデータ解析までの哺乳類細胞におけるトロントノックアウトライブラリー(TKOv1またはv3)を用いてゲノムスケールCRISPR-Cas9の機能喪失スクリーニングのための詳細なスクリーニングプロトコルを提供します。このプロトコルは、トロントノックアウトライブラリを使用してスクリーニング用に最適化されていますが、適用でき、すべてのCRISPR sgRNAプールライブラリにスケーラブルにすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
使用の簡易性および高い準備性のために、CRISPRの技術は精密なゲノム編集のための選択の用具として広く採用されている。プールされたCRISPRスクリーニングは、単一の実験で何千もの遺伝的摂動を尋問する方法を提供する。プールされたスクリーンでは、sgRNAライブラリは分子バーコードとして機能し、各配列は一意であり、標的遺伝子にマッピングされます。細胞集団からゲノムDNAを分離?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ゲノムカナダ、オンタリオ州研究基金、およびカナダ保健研究所(MOP-142375、PJT-148802)によって支援されました。
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Riferimenti
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