Écrans génétiques crispR-basés en commun dans les cellules de mammifères
Summary
La technologie CRISPR-Cas9 fournit une méthode efficace pour modifier précisément le génome des mammifères dans n’importe quel type de cellule et représente un nouveau moyen d’effectuer des écrans génétiques à l’échelle du génome. Un protocole détaillé discutant des étapes requises pour la réussite des écrans CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome sont fournis ici.
Abstract
L’édition du génome à l’aide du système CRISPR-Cas a considérablement avancé la capacité d’éditer avec précision les génomes de divers organismes. Dans le contexte des cellules de mammifères, cette technologie représente un nouveau moyen d’effectuer des écrans génétiques à l’échelle du génome pour des études de génomique fonctionnelle. Les bibliothèques d’ARN guides (sgRNA) ciblant tous les cadres de lecture ouverts permettent la génération facile de milliers de perturbations génétiques dans un seul pool de cellules qui peuvent être dépistés pour des phénotypes spécifiques pour impliquer la fonction génique et les processus cellulaires dans un impartiale et systématique. Les écrans CRISPR-Cas fournissent aux chercheurs une méthode simple, efficace et peu coûteuse pour découvrir les plans génétiques des phénotypes cellulaires. En outre, l’analyse différentielle des écrans exécutés dans diverses lignées cellulaires et de différents types de cancer peut identifier des gènes qui sont contextuellement essentiels dans les cellules tumorales, révélant des cibles potentielles pour des thérapies anticancéreuses spécifiques. L’exécution d’écrans à l’échelle du génome dans les cellules humaines peut être intimidante, car cela implique la manipulation de dizaines de millions de cellules et nécessite l’analyse de grands ensembles de données. Les détails de ces écrans, tels que la caractérisation des lignées cellulaires, les considérations de bibliothèque CRISPR, et la compréhension des limites et des capacités de la technologie CRISPR au cours de l’analyse, sont souvent négligés. Fourni ici est un protocole détaillé pour la performance réussie des écrans à base de génome regroupés À l’échelle du génome CRISPR-Cas9.
Introduction
CRISPR-Cas, abrégé pour les répétitions palindromic courtes régulièrement interspatiales et les nucléases associées au CRISPR, se compose d’une seule protéine nucléase (p. ex. Cas9) en complexe avec un ARN guide synthétique (sgRNA). Ce complexe de ribonucléoprotéines cible l’enzyme Cas9 pour induire des ruptures d’ADN à double brin à un locus génomique spécifique1. Les pauses à double brin peuvent être réparées par l’intermédiaire d’une réparation dirigée par homologie (HDR) ou, plus généralement, par l’assemblage de fin non homologue (NHEJ), un mécanisme de réparation sujet aux erreurs qui entraîne une insertion et/ou des suppressions (INDELS) qui perturbent fréquemment la fonction génique. 1. L’efficacité et la simplicité de CRISPR permettent un niveau de ciblage génomique jusque-là inaccessible qui dépasse de loin les technologies précédentes d’édition du génome [c.-à-d. les nucléases de doigts de zinc (ZNF) ou les nucléases effectrices de type activateur de transcription ( TALENS), qui souffrent tous deux d’une complexité de conception accrue, d’une efficacité de transfection plus faible et de limitations dans l’édition de gènes multiplex2].
L’application de recherche fondamentale de l’édition du génome à base d’ARN à guide unique CRISPR a permis aux scientifiques d’interroger efficacement et à peu de frais les fonctions des gènes individuels et la topologie des réseaux d’interaction génétique. La capacité d’effectuer des écrans fonctionnels à l’échelle du génome a été grandement améliorée par l’utilisation du système CRISPR-Cas, en particulier par rapport aux technologies de perturbation génétique antérieures telles que l’interférence de l’ARN (ARNi) et la mutagénèse piège à gènes. En particulier, l’ARNi souffre d’effets hors cible élevés et d’un renversement incomplet, ce qui entraîne une sensibilité et une spécificité plus faibles par rapport à CRISPR3,4,5, tandis que les méthodes de piège à gènes ne sont réalisables que dans les haploïdes cellules pour les écrans de perte de fonction, limitant la portée des modèles cellulaires qui peuvent être interrogés6. La capacité de CRISPR à générer des éliminations génétiques complètes fournit un système plus biologiquement robuste pour interroger les phénotypes mutants, avec un faible bruit, des effets minimes hors cible et une activité constante entre les réactifs5. CrispR-Cas9 sgRNA bibliothèques qui ciblent l’ensemble du génome humain sont maintenant largement disponibles, permettant la génération simultanée de milliers de gènes knock-outs dans une seule expérience3,7,8,9 .
Nous avons mis au point des bibliothèques de lentilles sgRNA à l’échelle du génome CRISPR-Cas9 uniques appelées bibliothèques Toronto Knock-out (TKO) (disponibles par l’entremise d’Addgene) qui sont compactes et optimisées pour faciliter les écrans de génomique fonctionnelle à haute résolution. La dernière bibliothèque, TKOv3, cible 18 000 gènes de codage des protéines humaines avec 71 090 guides optimisés pour l’efficacité de l’édition à l’aide de données empiriques10. En outre, TKOv3 est disponible en tant que bibliothèque à un composant (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) exprimant Cas9 et sgRNAs sur un seul vecteur, allégeant la nécessité de générer des cellules stables exprimant Cas9, permettant à l’échelle du génome knock-out à travers un large éventail de types de cellules de mammifères. TKOv3 est également disponible dans un vecteur sans Cas9 (pLCKO2:TKOv3, Addgene ID 125517) et peut être utilisé dans les cellules qui expriment Cas911.
Une population cellulaire éditée par LE CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome peut être exposée à différentes conditions de croissance, l’abondance de sgARN au fil du temps étant quantifiée par le séquençage de la prochaine génération, fournissant une lecture pour évaluer le décrochage ou l’enrichissement des cellules ayant une génétique traçable perturbations. Les bibliothèques KNOCK-out CRISPR peuvent être exploitées pour identifier les gènes qui, lors d’une perturbation, causent des défauts de forme physique cellulaire, une sensibilité modérée aux médicaments (p. ex., des gènes sensibles ou résistants), régulent l’expression des protéines (p. ex., journaliste) ou sont nécessaires pour un certain fonction de voie et état cellulaire12,13,14. Par exemple, les écrans différentiels de forme physique dans une ligne de cellules cancéreuses peuvent identifier l’épuisement ou la réduction des oncogènes et de l’enrichissement ou une augmentation des gènes de suppresseurs de tumeur3,14,15. De même, l’utilisation de doses intermédiaires de médicaments thérapeutiques peut révéler à la fois la résistance aux médicaments et les gènes de sensibilisation16,17.
Il s’agit ici d’un protocole de dépistage détaillé pour le dépistage de la perte de fonction CRISPR-Cas9 à l’échelle du génome à l’aide des bibliothèques Knock-out de Toronto (TKOv1 ou v3) dans les cellules des mammifères, de la génération de bibliothèques, du rendement du dépistage à l’analyse des données. Bien que ce protocole ait été optimisé pour le dépistage à l’aide des bibliothèques Knock-out de Toronto, il peut être appliqué et devenir évolutif dans toutes les bibliothèques regroupées CRISPR sgRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
En raison de sa simplicité d’utilisation et de sa grande souplesse, la technologie CRISPR a été largement adoptée comme outil de choix pour l’édition précise du génome. Le dépistage CRISPR mis en commun fournit une méthode pour interroger des milliers de perturbations génétiques dans une seule expérience. Dans les écrans mis en commun, les bibliothèques sgRNA servent de codes-barres moléculaires, car chaque séquence est unique et est cartographiée selon le gène ciblé. En isolant l’ADN génomique de la …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par Génome Canada, le Fonds de recherche de l’Ontario et les Instituts de recherche en santé du Canada (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Riferimenti
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
