Schermi genetici basati su CRISPR in cellule mammaliane
Summary
La tecnologia CRISPR-Cas9 fornisce un metodo efficiente per modificare con precisione il genoma dei mammiferi in qualsiasi tipo di cellula e rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che illustra i passaggi necessari per il successo delle prestazioni degli schermi CRISPR-Cas9 a livello di genoma raggruppato.
Abstract
L’editing del genoma utilizzando il sistema CRISPR-Cas ha notevolmente avanzato la capacità di modificare con precisione i genomi di vari organismi. Nel contesto delle cellule dei mammiferi, questa tecnologia rappresenta un nuovo mezzo per eseguire schermi genetici a livello di genoma per studi di genomica funzionale. Le librerie di RNA guida (sgRNA) rivolti a tutti i frame di lettura aperti consentono la facile generazione di migliaia di perturbazioni genetiche in un singolo pool di cellule che possono essere sottoposte a screening per fenotipi specifici per implicare la funzione genica e i processi cellulari in un modo imparziale e sistematico. Gli schermi CRISPR-Cas forniscono ai ricercatori un metodo semplice, efficiente ed economico per scoprire i progetti genetici per i fenotipi cellulari. Inoltre, l’analisi differenziale degli schermi eseguiti in varie linee cellulari e da diversi tipi di cancro può identificare geni che sono contestualmente essenziali nelle cellule tumorali, rivelando potenziali bersagli per specifiche terapie anticancro. L’esecuzione di schermi a livello di genoma nelle cellule umane può essere scoraggiante, in quanto ciò comporta la gestione di decine di milioni di cellule e richiede l’analisi di grandi insiemi di dati. I dettagli di queste schermate, come la caratterizzazione della cella, le considerazioni sulla libreria CRISPR e la comprensione delle limitazioni e delle funzionalità della tecnologia CRISPR durante l’analisi, sono spesso trascurati. Qui è fornito un protocollo dettagliato per il successo delle prestazioni di successo di schermi basati su genomica in pool CRISPR-Cas9.
Introduction
CRISPR-Cas, abbreviazione per brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate e nuclease associate a CRISPR, è costituito da una singola proteina nucleasi (ad esempio Cas9) in complesso con una guida sintetica RNA (sgRNA). Questo complesso di ribonucleoproteina si rivolge all’enzima Cas9 per indurre rotture di DNA a doppio filamento in uno specifico locus genomico1. Le rotture a doppio filamento possono essere riparate tramite riparazione diretta homologia (HDR) o, più comunemente, attraverso l’unione finale non omologa (NHEJ), un meccanismo di riparazione soggetto a errori che si traduce in inserimento e/o delezioni (INDELS) che spesso interrompono la funzione genica 1. L’efficienza e la semplicità di CRISPR consentono un livello di target genomico precedentemente irraggiungibile che supera di gran lunga le precedenti tecnologie di editing del genoma [ad esempio, nucleasi di dita di zinco o trascrittiviere nuosi effettore simili a TALENS), entrambi affetti da una maggiore complessità progettuale, da una minore efficienza di trasfezione e da limitazioni nell’editing genico multiplex2].
L’applicazione di ricerca di base dell’editing del genoma basato sull’RNA CRISPR ha permesso agli scienziati di interrogare in modo efficiente ed economico le funzioni dei singoli geni e la topologia delle reti di interazione genetica. La capacità di eseguire schermi funzionali ad ampio raggio su genoma è stata notevolmente migliorata dall’uso del sistema CRISPR-Cas, in particolare se confrontato con le precedenti tecnologie di perturbazione genetica come l’interferenza dell’RNA (RNAi) e la mutagenesi della trappola genica. In particolare, l’RNAi soffre di elevati effetti fuori bersaglio e knockdown incompleto, con conseguente minore sensibilità e specificità rispetto al CRISPR3,4,5, mentre i metodi di trappola genica sono fattibili solo in aploide celle per le schermate di perdita della funzione, limitando l’ambito dei modelli cellulari che possono essere interrogati6. La capacità di CRISPR di generare un sistema completo di eliminazione genica fornisce un sistema più biologicamente robusto per interrogare i fenotipi mutanti, con basso rumore, effetti minimi fuori bersaglio e un’attività costante tra i reagenti5. Le librerie di sgRNA CRISPR-Cas9 che si rivolgono all’intero genoma umano sono ora ampiamente disponibili, consentendo la generazione simultanea di migliaia di eliminazioni geniche in un singolo esperimento3,7,8,9 .
Abbiamo sviluppato uniche librerie di lentivirali sgRNAvirale a livello genomico CRISPR-Cas9 chiamate le librerie di Toronto Knock-out (TKO) (disponibili tramite Addgene) compatte e ottimizzate per la sequenza per facilitare schermi genomici funzionali ad alta risoluzione. L’ultima libreria, TKOv3, si rivolge a 18.000 geni di codifica delle proteine umane con 71.090 guide ottimizzate per l’editing dell’efficienza utilizzando dati empirici10. Inoltre, TKOv3 è disponibile come libreria a un componente (LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294) che esprime Cas9 e sgRNA su un singolo vettore, alleviando la necessità di generare celle stabili e che esprimono Cas9, consentendo l’eliminazione a livello di genoma in un’ampia gamma di tipi di cellule dei mammiferi. TKOv3 è disponibile anche in un vettore senza Cas9 (pLCKO2::TKOv3, Addgene ID 125517) e può essere utilizzato in celle che esprimono Cas911.
Una popolazione cellulare modificata CRISPR-Cas9 a livello di genoma può essere esposta a diverse condizioni di crescita, con l’abbondanza di sgRNA nel tempo quantificati dal sequenziamento di prossima generazione, fornendo una lettura per valutare l’abbandono o l’arricchimento delle cellule con genetica tracciabile Perturbazioni. Le librerie knock-out CRISPR possono essere sfruttate per identificare i geni che, dopo la perturbazione, causano difetti di forma fisica cellulare, sensibilità moderata ai farmaci (ad esempio, geni sensibili o resistenti), regolano l’espressione proteica (ad esempio, reporter) o sono necessari per un certo funzione del percorso e lo stato cellulare12,13,14. Ad esempio, schermi di fitness differenziale in una linea cellulare del cancro in grado di identificare sia l’esaurimento o la riduzione di oncogeni e arricchimento o un aumento dei geni soppressori tumorali3,14,15. Allo stesso modo, l’uso di dosi intermedie di farmaci terapeutici può rivelare sia la resistenza ai farmaci che i geni di sensibilizzazione16,17.
Fornito qui è un protocollo di screening dettagliato per lo screening della perdita di perdita CRISPR-Cas9 su scala genomica utilizzando le librerie Knock-out di Toronto (TKOv1 o v3) nelle cellule dei mammiferi dalla generazione di librerie, dalle prestazioni di screening all’analisi dei dati. Anche se questo protocollo è stato ottimizzato per lo screening utilizzando le librerie Knock-out di Toronto, può essere applicato e diventare scalabile a tutte le librerie in pool di sgRNA CRISPR.
Protocol
Representative Results
Discussion
Grazie alla sua semplicità d’uso e all’elevata flessibilità, la tecnologia CRISPR è stata ampiamente adottata come strumento di scelta per un montaggio preciso del genoma. Lo screening CRISPR in pool fornisce un metodo per interrogare migliaia di perturbazioni genetiche in un singolo esperimento. Negli schermi in pool, le librerie di sgRNA fungono da codici a barre molecolari, poiché ogni sequenza è unica ed è mappata al gene mirato. Isolando il DNA genomico della popolazione cellulare, i geni che causano il fenoti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da Genome Canada, Ontario Research Fund e Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Riferimenti
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
