포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린
Summary
CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.
Abstract
CRISPR-Cas 시스템을 이용한 게놈 편집은 다양한 유기체의 게놈을 정밀하게 편집하는 능력을 크게 향상시켰습니다. 포유류 세포의 맥락에서, 이 기술은 기능적 유전체학 연구를 위한 게놈 전체 유전 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타낸다. 모든 개방된 판독 프레임을 대상으로 하는 가이드 RNA(sgRNA) 라이브러리는 특정 표현형에 대해 선별될 수 있는 단일 세포 풀에서 수천 개의 유전 적 교란을 생성하여 유전자 기능 및 세포 프로세스에 연루되도록 허용합니다. 편견과 체계적인 방법. CRISPR-Cas 스크린은 세포 표현형을 위한 유전 청사진을 밝히기 위하여 간단하고, 능률적이고, 저렴한 방법을 연구원에게 제공합니다. 게다가, 각종 세포주및 다른 암 모형에서 수행된 스크린의 차등 분석은 특정 항암 치료에 대한 잠재적인 표적을 드러내는 종양 세포에 문맥상 필수적인 유전자를 확인할 수 있습니다. 인간 세포에서 게놈 전체 스크린을 수행하는 것은 수천만 개의 세포를 처리하는 것을 포함하고 대량의 데이터 집합의 분석을 요구하기 때문에 어려울 수 있습니다. 세포주 특성화, CRISPR 라이브러리 고려 사항, 분석 중 CRISPR 기술의 한계와 기능 이해 와 같은 이러한 화면의 세부 사항은 종종 간과됩니다. 여기에 제공된 풀드게놈 전체 CRISPR-Cas9 기반 스크린의 성공적인 성능을 위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다.
Introduction
CRISPR-Cas는 정기적으로 스패니싱된 짧은 팔린드로믹 반복 및 CRISPR 관련 뉴클레아제에 대한 짧은, 합성 가이드 RNA(sgRNA)와 복합체에서 단일 뉴클레아제 단백질(예를 들어, Cas9)으로 구성된다. 이 리보뉴클레오 단백질 복합체는 Cas9 효소를 표적으로 하여 특정 게놈 궤적1에서이중 가닥 DNA 분리를 유도합니다. 이중 가닥 휴식은 상동성 지시 수리 (HDR) 또는, 더 일반적으로, 비 상동성 끝 접합을 통해 복구 할 수 있습니다 (NHEJ), 삽입 및 / 또는 삭제 (INDELS)를 자주 중단하는 오류 경향이 수리 메커니즘 1. CRISPR의 효율성과 단순성은 이전의 게놈 편집 기술 [즉, 아연 손가락 뉴클레아제 (ZNF) 또는 전사 활성제 와 같은 이펙터 뉴클레아제 (nucleion)를 훨씬 능가하는 이전에 는 달성 할 수없는 수준의 게놈 표적화를 가능하게합니다. TALENS), 둘 다 높아진 설계 복잡성, 낮은 형질 감염 효율 및 멀티플렉스 유전자 편집의 한계로 고통받고있습니다 2].
CRISPR 단일 가이드 RNA 기반 게놈 편집의 기본 연구 응용 프로그램은 과학자들이 개별 유전자의 기능과 유전자 상호 작용 네트워크의 토폴로지의 기능을 효율적이고 저렴하게 심문할 수 있게 해 주어왔습니다. 기능적 게놈 전체 스크린을 수행하는 능력은 CRISPR-Cas 시스템의 사용에 의해 크게 향상되었습니다, 특히 RNA 간섭과 같은 초기 유전 섭동 기술과 비교할 때 (RNAi) 및 유전자 트랩 돌연변이 발생. 특히, RNAi는 높은 오프 타겟 효과와 불완전한 녹다운으로 고통받고 있으며, CRISPR3,4,5에비해 감도와 특이성이 낮으며 유전자 트랩 방법은 haploid에서만 가능합니다. 기능 상실 스크린을 위한 셀, 심문될 수 있는 세포 모형의 범위를 제한하는6. 완전한 유전자 녹아웃을 생성하는 CRISPR의 능력은 낮은 소음, 최소한의 오프 타겟 효과 및 시약 전반에 걸쳐 일관된 활성으로 돌연변이 표현형을 심문하는 보다 생물학적으로 견고한 시스템을 제공합니다5. 전체 인간 게놈을 표적으로 하는 CRISPR-Cas9 sgRNA 라이브러리는 이제 널리 사용가능하여 단일 실험3,7,8,9에서 수천 개의 유전자 녹아웃을 동시에 생성할 수 있습니다. .
우리는 고해상도 기능 유전체 학 스크린을 용이하게하기 위해 컴팩트하고 시퀀스 최적화 된 토론토 녹아웃 (TKO) 라이브러리 (Addgene를 통해 사용 가능)라는 독특한 CRISPR-Cas9 게놈 넓은 sgRNA 렌티 바이러스 라이브러리를 개발했습니다. 최신 라이브러리인 TKOv3는 경험적 데이터를 사용하여 편집 효율에 최적화된 71,090개의 가이드를 사용하여 ~18,000개의 인간 단백질 코딩 유전자를 대상으로합니다 10. 또한 TKOv3는 단일 벡터에서 Cas9 및 sgRNAs를 발현하는 단일 구성 요소 라이브러리(LCV2::TKOv3, Addgene ID #90294)로 사용할 수 있으므로 안정적인 Cas9 발현 셀을 생성할 필요성을 완화하여 광범위한 범위에서 게놈 전체 녹아웃을 가능하게 합니다. 포유류 세포 유형. TKOv3는 Cas9(pLCKO2:TKOv3, Addgene ID# 125517)가 없는 벡터에서도 사용할 수 있으며 Cas911을발현하는 셀에서 활용될 수 있다.
게놈 넓은 CRISPR-Cas9 편집된 세포 인구는 다른 성장 조건에 드러낼 수 있고, 차세대 염기서열로 정량화된 sgRNAs의 풍부와 함께, 추적 가능한 유전을 가진 세포의 중퇴 또는 농축을 평가하기 위하여 판독을 제공하 교란. CRISPR 녹아웃 라이브러리는 섭동시, 세포 적당 결함, 적당한 약물 민감도(예: 민감하거나 내성 있는 유전자), 단백질 발현 조절(예: 리포터) 또는 특정에 필요한 유전자를 식별하기 위해 활용될 수 있습니다. 통로 기능 및 세포 상태12,13,14. 예를 들어, 암 세포주에서의 차동 피트니스 스크린은 종양 억제유전자 유전자3,14,15의고갈 또는 감소 또는 종양 억제유전자의 증가를 식별할 수 있다. 유사하게, 치료약물의 중간 용량을 사용하면 약물 내성 및 과민성 유전자 둘 다 를 나타낼 수있다 16,17.
여기에 제공된 유전체 스케일 CRISPR-Cas9 기능 손실 스크리닝을 위한 상세한 스크리닝 프로토콜은 라이브러리 생성으로부터 포유류 세포에서 토론토 녹아웃 라이브러리(TKOv1 또는 v3)를 사용하여, 데이터 분석에 대한 스크리닝 성능이다. 이 프로토콜은 토론토 녹아웃 라이브러리를 사용하여 스크리닝에 최적화되었지만 모든 CRISPR sgRNA 풀린 라이브러리에 적용하여 확장 가능해질 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
사용의 단순성과 높은 유연성으로 인해 CRISPR 기술은 정밀한 게놈 편집을 위한 도구로 널리 채택되었습니다. 풀린 CRISPR 스크리닝은 단일 실험에서 수천 개의 유전적 교란을 심문하는 방법을 제공합니다. 풀린 스크린에서, sgRNA 라이브러리는 각 순서가 고유하고 표적으로 한 유전자에 매핑되기 때문에 분자 바코드로 봉사합니다. 세포 집단으로부터 게놈 DNA를 분리함으로써, 관심표현형을 일으키는 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 일은 게놈 캐나다, 온타리오 연구 기금 및 건강 연구를 위한 캐나다 학회 (MOP-142375, PJT-148802)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Riferimenti
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