Samlede CRISPR-baserte genetiske skjermer i pattedyrceller
Summary
CRISPR-Cas9 teknologien skaffer en effektiv metoden å presist redigere det pattedyr Genova dersom noe cellen type og representerer en ny betyr å utføre Genova-bred genetisk skjermene. En detaljert protokoll diskuterer trinnene som kreves for vellykket gjennomføring av samlet Genova hele CRISPR-Cas9 skjermene er gitt her.
Abstract
Genova redigere bort benytter det CRISPR-CAS system har kraftig avansert evnen å presist redigere det genomer av forskjellige organisere. I sammenheng med pattedyrceller, representerer denne teknologien en roman betyr å utføre Genova-brede genetiske skjermer for funksjonell Genomics studier. Bibliotekene for guide RNAs (sgRNA) målretting alle åpne lese RAM mer tillate facile generasjon av tusenvis av genetiske forstyrrelser i en enkelt pool av celler som kan bli vist for bestemte fenotyper å implisere gen funksjon og cellulære prosesser i en på en upartisk og systematisk måte. CRISPR-CAS-skjermene gir forskere en enkel, effektiv og rimelig metode for å avdekke de genetiske tegningene for mobil fenotyper. Videre differensial analyse av skjermer utført i ulike cellelinjer og fra ulike krefttyper kan identifisere gener som er innholdsrettede essensielle i tumorceller, avslørende potensielle mål for bestemte anticancer terapier. Utføring av Genova-skjermer i menneskelige celler kan være skremmende, da dette innebærer håndtering av titalls millioner av celler og krever analyse av store datasett. Detaljene av disse skjermene, som cellelinje karakterisering, CRISPR biblioteket betraktninger, og forstå begrensningene og egenskapene til CRISPR teknologi under analyse, blir ofte oversett. Forsynt her over er en detaljert protokollen for det heldig gjennomførelse av samlet Genova-bred CRISPR-Cas9 basert skjermene.
Introduction
CRISPR-CAS, forkortelse for gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic repetisjoner og CRISPR-Associated nuklease, består av et enkelt nuklease protein (f. eks Cas9) i komplekse med en syntetisk guide RNA (sgRNA). Dette ribonucleoprotein komplekse mål Cas9 enzymet å indusere dobbel-strandet DNA pauser på en bestemt genomisk geometriske1. Double-strandet pauser kan repareres via homologi rettet reparasjon (HDR) eller, oftere, gjennom ikke-homologe ende sammenføyning (NHEJ), en feil utsatt reparasjon mekanisme som resulterer i innsetting og/eller slettinger (INDELER) som ofte forstyrrer gen funksjon 1. effektiviteten og enkelhet av CRISPR aktiverer en tidligere uoppnåelig nivå av genomisk målgruppe som langt overgår tidligere Genova redigering teknologier [dvs., sink finger NUKLEASER (ZNF) eller transkripsjon aktivator-lignende effektor nukleaser ( TALENS), som begge lider av økt design kompleksitet, lavere transfeksjoner effektivitet, og begrensninger i multiplex genredigering2].
Den grunnleggende forskning anvendelse av CRISPR single-guide RNA-baserte Genova redigering har tillatt forskerne å effektivt og billig avhøre funksjonene til individuelle gener og topologi av genetisk interaksjon nettverk. Evnen å utføre funksjonell Genova-bred skjermene er blitt høyeste forsterket av bruk av det CRISPR-CAS system, spesielt når sammenlignet med tidligere genetisk forstyrrelsene teknologiene som RNA innblanding (RNAi) og gen felle mutagenese. Spesielt lider RNAi fra høye off-Target effekter og ufullstendige knockdown, noe som resulterer i lavere følsomhet og spesifisitet i forhold til CRISPR3,4,5, mens genet felle metoder er bare gjennomførbart i haploide celler for skjermbilder med tap av funksjon, som begrenser omfanget av celle modeller som kan bli avhørt6. CRISPR evne til å generere fullstendig gen-Knock-Out gir et mer biologisk robust system for å forhøre mutert fenotyper, med lavt støynivå, minimale off-mål-effekter og konsistent aktivitet på tvers av reagenser5. CRISPR-Cas9 sgRNA biblioteker som er rettet mot hele menneskelige Genova er nå allment tilgjengelig, slik at samtidig generasjon av tusenvis av genet knock-outs i en enkelt eksperiment3,7,8,9 .
Vi har utviklet unike CRISPR-Cas9 Genova-brede sgRNA lentiviral bibliotekene kalt Toronto Knock-Out (TKO) bibliotekene (tilgjengelig gjennom Addgene) som er kompakte og sekvens-optimalisert for å lette høyoppløselig funksjonell Genomics skjermer. Den nyeste biblioteket, TKOv3, mål ~ 18 000 Human protein-koding gener med 71 090 guider optimalisert for redigering effektivitet ved hjelp av empiriske data10. I tillegg er TKOv3 tilgjengelig som en en-komponent bibliotek (LCV2:: TKOv3, Addgene ID #90294) uttrykker Cas9 og sgRNAs på en enkelt vektor, lindre behovet for å generere stabile Cas9-uttrykker celler, slik at Genova-brede Knock-Out over et bredt spekter av pattedyr celletyper. TKOv3 er også tilgjengelig i en vektor uten Cas9 (pLCKO2:: TKOv3, Addgene ID # 125517) og kan brukes i celler som uttrykker Cas911.
En Genova-brede CRISPR-Cas9 redigert celle befolkningen kan bli utsatt for ulike vekstforhold, med overflod av sgRNAs over tid kvantifisert av neste generasjons sekvensering, gir en avlesning for å vurdere drop-out eller berikelse av celler med sporbar genetisk forstyrrelser. CRISPR Knock-Out biblioteker kan utnyttes til å identifisere gener som, ved forstyrrelsene, forårsake cellulære egnethet defekter, moderat narkotika følsomhet (f. eks følsomme eller resistente gener), regulere protein uttrykk (f. eks, reporter), eller er nødvendig for en viss Pathway funksjon og mobil tilstand12,13,14. For eksempel kan differensial fitness skjermer i en kreftcelle linje identifisere både forringelse eller reduksjon av oncogenes og berikelse eller en økning av tumor Suppressors gener3,14,15. På samme måte kan bruk av mellomliggende doser av terapeutiske legemidler avdekke både resistens og allergi gener16,17.
Forutsatt her er en detaljert screening protokoll for Genova-skala CRISPR-Cas9 tap-av-funksjon screening ved hjelp av Toronto Knock-Out bibliotekene (TKOv1 eller v3) i pattedyrceller fra biblioteket generasjon, screening ytelse til dataanalyse. Selv om denne protokollen er optimalisert for screening ved hjelp av Toronto Knock-Out biblioteker, kan den brukes og bli skalerbar for alle CRISPR sgRNA gruppert bibliotekene.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grunn av sin enkelhet i bruk og høy pliability, CRISPR teknologi har vært allment vedtatt som verktøy for å velge nøyaktig Genova redigering. Gruppert CRISPR-screening gir en metode for å forhøre tusenvis av genetiske forstyrrelser i et enkelt eksperiment. I grupperte skjermer tjener sgRNA-biblioteker som molekylære strekkoder, ettersom hver sekvens er unik og er kartlagt i det målrettede genet. Ved å isolere genomisk DNA fra cellen befolkning, gener forårsaker fenotype av interesse kan bestemmes av kvanti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Genova Canada, Ontario Research Fund, og Canadian Institutes for Health Research (MOP-142375, PJT-148802).
Materials
| 0.22 micron filter | |||
| 30°C plate incubator | |||
| 37°C shaking incubator | |||
| 37°C, 5% CO2 incubator | |||
| 5 M NaCl | Promega | V4221 | |
| 50X TAE buffer | BioShop | TAE222.4 | |
| 6 N Hydrochloric acid solution | BioShop | HCL666.500 | |
| 95% Ethanol | |||
| Alamar blue | ThermoFisher Scientific | DAL1025 | |
| Blue-light transilluminator | ThermoFisher Scientific | G6600 | |
| Bovine Serum Albumin,Heat Shock Isolation, Fraction V. Min. 98%, Biotechnology grade | Bioshop | ALB001.250 | |
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium | Life Technologies | 11995-065 | Cel culture media |
| Electroporation cuvettes | BTX | 45-0134 | |
| Electroporator | BTX | 45-0651 | |
| Endura electrocompetent cells | Lucigen | 90293 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | 12483-020 | |
| HEK293T packaging cells | ATCC | CRL-3216 | recommend passage number <15 |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | Sigma | H9268 | Cationic polymer to enhance transduction efficiency |
| Hexadimethrine Bromide (Polybrene) | |||
| LB agar plates with carbenicillin | |||
| LB medium with carbenicillin | |||
| Low molecular weight DNA ladder | New England Biolabs | N3233S | |
| Nanodrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-ONE-W | |
| NEBNext Ultra II Q5 Master Mix | New England Biolabs | M0544L | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Reduced serum media |
| Plasmid maxi purification kit | Qiagen | 12963 | |
| pMD2.G (envelope plasmid) | Addgene | Plasmid #12259 | lentiviral system |
| psPAX2 (packaging plasmid) | Addgene | Plasmid #12260 | lentiviral system |
| Puromycin | Wisent | 400-160-UG | |
| QIAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Qubit dsDNA BR assay | ThermoFisher Scientific | Q32853 | |
| Qubit fluorometer | ThermoFisher Scientific | Q33226 | |
| RNAse A | Invitrogen | 12091021 | |
| S.O.C recovery medium | Invitrogen | 15544034 | |
| SYRB Safe DNA gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – Cas9 included | Addgene | Addgene ID #90203 | Genome-wide CRISPR library , includes Cas9, 71,090 sgRNA |
| Toronto KnockOut CRIPSR library (TKOv3) – non-cas9 | Addgene | Addgene ID #125517 | Genome-wide CRISPR library, non-Cas9, 71,090 sgRNA |
| Tris-EDTA (TE) solution, pH8.0 | |||
| UltraPure agarose | ThermoFisher Scientific | 16500500 | |
| Wizard genomic DNA purification kit | Promega | A1120 | |
| X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent | Roche | 06 365 809 001 | Lipid based transfection reagent |
Riferimenti
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms. Annual Review of Biophysics. 46, 505-529 (2017).
- Baliou, S., et al. CRISPR therapeutic tools for complex genetic disorders and cancer (Review). International Journal of Oncology. 53 (2), 443-468 (2018).
- Hart, T., et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
- Morgens, D. W., Deans, R. M., Li, A., Bassik, M. C. Systematic comparison of CRISPR/Cas9 and RNAi screens for essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 634-636 (2016).
- Evers, B., et al. CRISPR knock-out screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Miles, L. A., Garippa, R. J., Poirier, J. T. Design, execution, and analysis of pooled in vitro CRISPR/Cas9 screens. The FEBS Journal. 283 (17), 3170-3180 (2016).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
- Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nature Communications. 9 (1), 5416 (2018).
- Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knock-out Screens. G3: Genes|Genomes|Genetics. 7 (8), 2719-2727 (2017).
- Mair, B., Tomic, J., et al. Essential gene profiles for human pluripotent stem cells identify uncharacterized genes and substrate dependencies. Cell Reports. 27 (2), 599-615 (2019).
- Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knock-out screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
- Steinhart, Z., et al. Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors. Nature Medicine. 23 (1), 60-68 (2017).
- Wang, T., et al. Gene Essentiality Profiling Reveals Gene Networks and Synthetic Lethal Interactions with Oncogenic Ras. Cell. 168 (5), 890-903 (2017).
- Zimmermann, M., et al. CRISPR screens identify genomic ribonucleotides as a source of PARP-trapping lesions. Nature. 559 (7713), 285-289 (2018).
- Deans, R. M., et al. Parallel shRNA and CRISPR-Cas9 screens enable antiviral drug target identification. Nature Chemical Biology. 12 (5), 361-366 (2016).
- Trinh, T. J. J., Bloom, F., Hirsch, V. STBL2: an Escherichia coli strain for the stable propagation of retroviral clones and direct repeat sequences. Focus. 16, 78-80 (1994).
- Hart, T., Moffat, J. BAGEL: a computational framework for identifying essential genes from pooled library screens. BMC Bioinformatics. 17, 164 (2016).
- Wang, G. Z. M., et al. Identifying drug-gene interactions from CRISPR knock-out screens with drugZ. bioRxiv. , (2017).
- Pedregosa, F. V., G, , et al. Scikit-learn: Machine Learning in Python. Journal of Machine Learning Research. 12, 2825-2830 (2011).
- Ketela, T., et al. A comprehensive platform for highly multiplexed mammalian functional genetic screens. BMC Genomics. 12, 213 (2011).
- Doench, J. G. Am I ready for CRISPR? A user’s guide to genetic screens. Nature Review Genetics. 19 (2), 67-80 (2018).
- Hartenian, E., Doench, J. G. Genetic screens and functional genomics using CRISPR/Cas9 technology. FEBS Journal. 282 (8), 1383-1393 (2015).
- Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knock-out screens. Genome Biology. 15 (12), 554 (2014).
- Sheel, A., Xue, W. Genomic Amplifications Cause False Positives in CRISPR Screens. Cancer Discovery. 6 (8), 824-826 (2016).
- Meyers, R. M., et al. Computational correction of copy number effect improves specificity of CRISPR-Cas9 essentiality screens in cancer cells. Nature Genetics. 49 (12), 1779-1784 (2017).
- Henser-Brownhill, T., Monserrat, J., Scaffidi, P. Generation of an arrayed CRISPR-Cas9 library targeting epigenetic regulators: from high-content screens to in vivo assays. Epigenetics. 12 (12), 1065-1075 (2017).
