Articolo metodologico

Angiografia di fluorescenza per la valutazione dell'aneurisma perfusione e patriera arteriosa dei genitori nei modelli di aneurisma per ratti e conigli

DOI:

10.3791/59782

⸱

24 luglio 2019

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1Department of Neurosurgery, Kantonsspital Aarau, 2Cerebrovascular Research Group, Department for BioMedical Research (DBMR), University of Bern

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un protocollo per valutare in modo efficiente la perfusione di aneurisma e la patenza del recipiente dell'aneurisma laterale in ratti e conigli, utilizzando l'angiografia videoatologa (FVA) a fluorescenza a base di fluorescenza. Con un valore predittivo positivo del 92,6%, si tratta di un metodo semplice ma molto efficace ed economico senza attrezzature speciali richieste.

Abstract

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Trattamento dell'aneurisma cerebrale si concentra sul raggiungimento di occlusione completa, così come preservare il flusso sanguigno nell'arteria genitore. Fluoresceina sodio e verde indocianina sono utilizzati per consentire l'osservazione del flusso sanguigno e lo stato di perfusione del vaso, rispettivamente. Lo scopo di questo studio è quello di applicare l'FVA per verificare il flusso sanguigno in tempo reale, lo stato di perfusione del vaso e l'occlusione degli aneurismi dopo l'induzione di aneurismi sidewall in conigli e ratti, nonché per convalidare la procedura in queste specie.

Venti aneurismi laterali sono stati creati in 10 conigli suturando un sacchetto del vaso arterioso decellularizzato sull'arteria carotide di un coniglio donatore. Inoltre, 48 aneurismi microchirurgici laterali sono stati creati in 48 ratti. Durante il follow-up ad un mese dopo la creazione, il complesso dell'arteria/aneurisma genitore è stato sezionato e l'FVA è stata eseguita utilizzando un'iniezione di fluoresceina endovenosa (10%, 1 mL) tramite cateterizzazione della vena dell'orecchio nei conigli e una catherizzazione della vena femorale nei ratti. Gli aneurismi sono stati poi raccolti, e la patenza è stata valutata macroscopicamente.

Macroscopicamente, 14 aneurismi su 16 nei conigli non indicavano alcuna perfusione di arteria madre residua con luminae totalmente occlusa, tuttavia 11 (79%) sono stati rilevati dall'FVA. Quattro aneurismi sono stati esclusi a causa di problemi tecnici. Nei ratti, la perfusione dell'aneurisma residuo è stata osservata macroscopicamente in 25 casi su 48. Dei 23 senza prove macroscopiche di perfusione, FVA ha confermato l'incidenza di 22 aneurismi (96%). Non ci sono stati eventi avversi associati all'FVA. La fluoresceina è facilmente applicabile e non è necessaria alcuna attrezzatura speciale. È un metodo sicuro ed estremamente efficace per valutare l'integrità dell'arteria genitore e la perfusione aneurisma/perfusione residua in un ambiente sperimentale con conigli e ratti. L'FVA che utilizza la fluoresceina come agente di contrasto sembra essere efficace nel controllare la patenza degli aneurismi e del recipiente sottostante e può anche essere adattata per bypassare la chirurgia.

Introduzione

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La prova dell'aneurisma completo e dell'integrità dell'arteria genitore è della massima importanza nella chirurgia dell'aneurisma. Ci sono diverse opzioni per confermare la patenza dell'arteria madre e l'occlusione dell'aneurisma, come la sonografia Doppler, l'angiografia cerebrale convenzionale (DSA), l'angiografia della tomografia computerizzata (CTA) o l'angiografia a risonanza magnetica (MRA)1, 2.Tuttavia, si tratta di metodi costosi e dispendiosi in termini di tempo che spesso non sono disponibili in laboratorio. Inoltre, possono avere effetti collaterali rilevanti come l'esposizione alle radiazioni o la necessità di una sedazione aggiuntiva di animali sperimentali per evitare il movimento artefatto.

Con l'emergere di un numero crescente di nuovi dispositivi endovascolari, è necessario testare in modo riservato tali dispositivi. Tuttavia, questi studi spesso si basano sull'analisi post-mortem (ad esempio, macro patologia e istologia) e mancano di informazioni sulla perfusione dinamica. Inoltre, per il ricercatore può essere fondamentale ottenere informazioni immediate e affidabili durante una procedura chirurgica sperimentale. L'angiografia della fluorescenza è una tecnica di visualizzazione conveniente e facile da eseguire1,3,4.

Come tale, l'angiografia videologica verde indocianina (ICG) è spesso utilizzata nelle procedure neurochirurgiche cliniche ed è stata ampiamente studiata5,6. L'angiografia video fluoresceina (FVA) è una tecnica alternativa, con l'ulteriore vantaggio di creare un segnale di fluorescenza che si trova all'interno della gamma di lunghezze d'onda della visione umana, e può quindi essere visto ad occhio nudo senza una telecamera a infrarossi a spettro esteso 7. L'angiografia video fluoresceina è meno spesso utilizzata nella chirurgia clinica cerebrovascolare e i rapporti sull'IEd in ambienti sperimentali sono scarsi1,4.

L'obiettivo di questa relazione è dimostrare la fattibilità e la portata delle applicazioni dell'IVA nella ricerca cerebrovascolare preclinica di ratti e conigli.

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Protocollo

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I roditori sono stati alloggiati in un impianto di cura degli animali e gli esperimenti sono stati esaminati e approvati dal Comitato per il benessere degli animali presso l'Università di Berna, in Svizzera (BE 108/16) e (BE65/16). Tutti gli animali sono stati mantenuti su una dieta di laboratorio standard con libero accesso al cibo e all'acqua. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti sotto un'attenta considerazione delle 3R (sostituzione, riduzione e raffinatezza). Sono stati inclusi dieci conigli bianchi neozelandesi e 48 topi Wistar maschi. Le linee guida DI ARRIVE sono state seguite rigorosamente8.

NOTA: Venti aneurismi di parete laterale sono stati creati in 10 conigli suturando una sacca decellularizzata del vaso arterioso sull'arteria carotide di un coniglio donatore. Inoltre, 48 aneurismi microchirurgici laterali sono stati creati in 48 ratti come descritto primadi 4,9. La procedura di imaging e l'analisi macroscopica sono state eseguite 4 settimane dopo la creazione dell'aneurisma.

1. Preparazione del materiale necessario per l'angiografia video fluoresceina

  1. Modificare la torcia toccando un filtro passabanda blu (vedere la Tabella dei Materiali), che funzionerà come filtro di eccitazione. La torcia dovrebbe quindi emettere solo luce blu. Utilizzare nastro nero per evitare perdite di luce non filtrata.
  2. Equipaggiare la fotocamera (ad esempio, attaccata al microscopio) con un filtro a banda verde (vedere la Tabella dei Materiali), che funzionerà come un filtro luminoso di emissione. Solo la luce verde dovrebbe ora essere in grado di passare attraverso.

2. Preparazione del luogo di lavoro e dei materiali

  1. Disinfettante lo spazio di lavoro con soluzione disinfettante.
  2. Coprire il tavolo con tende sterili per evitare contaminazioni.
  3. Utilizzare strumenti sterili per l'intervento chirurgico.

3. Preparazione di animali per l'intervento chirurgico

  1. Pesare gli animali.
  2. Indurre l'anestesia e regolare la dose in base al peso.
    1. Per i conigli, iniziare l'anestesia equilibrata. Proteggere gli occhi con una mano durante l'iniezione per ridurre la loro reazione spaventosa. Coprire la gabbia con un lenzuolo per aiutare a sedare gli animali.
    2. Anestesizzare i ratti in una camera a gas con il 4% di isoflurane e il 96% di ossigeno prima dell'iniezione.
  3. Monitorare la profondità dell'anestesia. Pizzicare tra le dita dei dati per assicurarsi che gli animali dormono.
    1. Riposiziona i conigli sulla schiena. Non dovrebbero reagire.
    2. Per i ratti,pizzicare la coda e assicurarsi che non si osservi alcuna reazione.
  4. Applicare unguento sugli occhi dei roditori per evitare la secchezza. Estrarre le lingue dei ratti per evitare qualsiasi possibilità di deglutizione.
  5. Inizia con la conservazione dell'anestesia.
    1. Per i conigli, cateterizzare (22 G catetere IV schermato con porta di iniezione, vedere la Tabella dei materiali) la vena dell'orecchio. Mantenere l'anestesia bilanciata. Utilizzare un stopcock a tre vie per consentire più iniezioni simultanee.
    2. Per i ratti, iniettare 50 mg/kg di cloridrato di chetamina e 0,5 mg/kg di idrocloruro medetominale per via intraperitamente. Monitorare l'anestesia con un pizzico nocivo durante l'intervento chirurgico. In caso di reazione, somministrare anestetico aggiuntivo.
  6. Nastro gli animali sulla scheda in posizione supina e radere strettamente la posizione di incisione. Disinfettare l'area con Betasettico.
    1. Per i conigli, disinfettare il collo, soprattutto intorno al muscolo sternocleidomastoide.
    2. Per i ratti, disinfettare l'area dalla vescica atransvers colon.
  7. Somministrare l'ossigeno attraverso una maschera durante l'intervento e mantenere la temperatura corporea con una piastra di riscaldamento.

4. Preparazione dell'arteria

  1. Per ottenere i migliori risultati, sezionare accuratamente il recipiente scelto dal tessuto circostante9,10.
    1. Per i ratti, identificare la vena della coda (meno invasiva, preferibilmente utilizzata per gli animali sopravvissuti) o sezionare una vena femorale per l'iniezione di fluoresceina4,11.
      NOTA: Per i conigli, non è necessaria alcuna ulteriore dissezione dei vasi per l'iniezione di fluoresceina poiché la vena dell'orecchio è già utilizzata per l'anestesia.
  2. Posizionare un tampone bianco sotto il recipiente scelto per aumentare il contrasto con il tessuto circostante.
  3. Mettere a fuoco la telecamera montata al microscopio sull'arteria sezionata.

5. Angiografia video fluoresceina

  1. Coprire la siringa da 5 mL ripiena di fluoresceina di sodio (100 mg/mL, vedere la tabella deimateriali) con un foglio di alluminio per proteggersi dall'esposizione della luce. Spegnere le luci (per quanto possibile) e iniettare fluoresceina di sodio per via endovenosa. Iniettare sotto l'oscurità per evitare il fotosbiancamento.
    1. Per iconigli, iniettare 0,3 mL/kg di fluoresceina di sodio attraverso il a tre vie nella vena auricolare cateterica.
    2. Per i ratti, iniettare 0,4 mL/kg di fluoresceina sodio nella vena femorale tramite un catetere o un ago 25 G.
  2. Sciacquare l'ago o il catetere con una soluzione salina da 0,5 ml per garantire che tutti i tincoli vengano iniettati.
  3. Illuminare il campo chirurgico con la torcia modificata.
  4. Iniziare le riprese con la fotocamera modificata. Il flusso sanguigno dovrebbe essere visibile pochi secondi dopo l'iniezione (Figura 1).
    NOTA: In questo caso, abbiamo utilizzato la frequenza fotogrammi : 50 fotogrammi/s, lunghezza focale , 70 mm e F3,4.

6. Analisi macroscopica

  1. Resect the aneuriss e l'arteria madre complesse, e valutare la patrocinata patrizio di patenza aprendo l'arteria genitore con micro-forbici e valutare il lume dell'arteria genitore e l'orifizio dell'anerys (vedi Figura 1, 2)9. Misurare le dimensioni degli aneurismi. L'aneurisma-genitore-complesso può quindi essere conservato per ulteriori analisi (ad esempio, istologia).

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Risultati

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La frequenza cardiaca e la pressione sanguigna sono state monitorate durante l'intervento chirurgico. La frequenza cardiaca media era 193/min nei conigli e 196/min nei ratti. Il peso corporeo dei conigli variava da 3,05-4,18 kg, e i ratti pesavano 335-690 g.

Siamo stati in grado di eseguire FVA in otto conigli su dieci (Figura 1). Quattro esami di aneurisma in due conigli non sono stati registrati con la telecamera a causa di difficoltà tecniche. Non sono state se...

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Discussione

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L'FVA è un metodo promettente e semplice per esaminare le navi nei roditori e può essere eseguita con dispositivi commerciali e attrezzature pronte all'uso. L'FVA può essere implementato durante qualsiasi intervento chirurgico in cui è necessaria una valutazione intraoperatoria dell'integrità della nave, poiché i vasi necessitano prima di essere adeguata.

Gli autori hanno preferito l'iniezione venosa all'iniezione arteriosa a causa del minor rischio di eventi involontari come infezione, ischem...

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Dichiarazioni

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Tutti gli autori non confermano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di ricerca del Kantonsspital Aarau, Svizzera.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Per conigli
Foglio
Rasoio
Nastro
Filtro bluThorlabs MF475-35
Piastra
FotocameraSony NEX-5R
Catetere22G Vasofix Safety
Disinfictant
Fluoresceina sodicaFluoresceina Faure 10%
Glas plate
Filtro verdeThorlabs MF539-43
per incontinenza
Pompa di infusionePerfusor Secura
Ketamina cloridratoqualsiasi prodotto generico
Ago25G
Ossigeno
Soluzione di
Fogli
Strumenti chirurgicimicro pinze, micro forbici, forbici chirurgiche smussate
Microscopio operatorioOPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania
Siringa 2ml, 5ml, 50ml
Nastro
Rubinetto
Torcia luminosa
Xylazinqualsiasi prodotto generico
Per ratti
Foglio di
Rasoio
Nastro
Filtro bluThorlabs MF475-35
Corpo piastra
FotocameraSony NEX-5R
Disinfictant
Fluoresceina sodicaFluoresceina Faure 10%
Filtro verdeThorlabs MF539-43
Tampone
Isoflurano
Ketamina cloridratoqualsiasi prodotto generico
Medetomidina cloridratoqualsiasi prodotto
Ago25G
Piastra di
ossigeno
Soluzione di
Fogli
Strumenti chirurgicimicro pinze, micro forbice, forbici chirurgiche smussate
Microscopio operatorioOPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germania
Siringa 2ml, 5ml
Nastro
Torcia luce
di alluminioper animalinerocalda per il corpoTampone Ringersterilia tre viealluminioper animalinerocaldaper incontinenzagenericoRingersterili

Riferimenti

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