במאמר זה, הצגנו מערכת של שיטות מעשיות ושימושיות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות של משפחת חיל-החוץ, הכוללים בתוך שיטת ההפעלה המבחנה, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי, ובחינה משלימה של פיצול לוציפראז.
במהירות מואצת פיברוסרקומה (חיל הים) המשפחה משחק תפקיד מרכזי בביולוגיה התא ותפקוד שלהם מוביל סרטן הפרעות התפתחותיות. אפיון של מוטציות הקשורות למחלות, יסייעו לנו לבחור אסטרטגיות טיפוליות מתאימות לטיפול במחלות אלה. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי משפחת החיל המלכותי מקיימים פעילויות קטליטי ו אלוסטריה, אשר מוסדרים באופן הדוק על ידי דימרזציה. כאן, בנינו קבוצה של שיטות מעשיות ובעלות הבנה כדי לקבוע את הפעילויות הקטליטיות והאלוסטרואיות והאהדה היחסית/יציבות של משפחת חיל-החוץ והמוטציות שלהם. ראשית, תוקנו הקלאסי בתוך שיטת החוץ מבחנה על ידי הפחתת הריכוז של חומרי ניקוי במאגרים, ניצול הליך שטיפה עדין מהיר, ושימוש בפיוז של גלוטתיון S-transferase (GT) כדי למנוע מהחיל המלכותי לנתק במהלך טיהור. הדבר מאפשר לנו למדוד את הפעילות הקטליטית של מוטציות באופן מכונן, הפועלים כראוי. שנית, פיתחנו רומן הפעלה שיתוף הספר של חיל הם כדי להעריך את הפעילות אלוסטריה של המוטציות המלח מתים של קינאז באמצעות N-terminal החלבונים מעוגלים, ביטול הדרישה של ראס פעיל בפרוטוקולים הנוכחיים ובכך להשיג גבוה יותר רגישות. לבסוף, יצרנו ייחודי מפוצל לוציפראז המשלים למדוד את היחס היחסי דיימר/יציבות של המוטציות השונות של חיל ההים, אשר אמין יותר ורגיש לעומת הimmunoprecipitation המסורתית שיתוף. לסיכום, לשיטות אלה יש את היתרונות הבאים: (1) ידידותי למשתמש; (2) מסוגל לבצע ביעילות ללא ציוד מתקדם; (3) חסכוני; (4) מאוד רגיש ומלא הבחנה.
משפחת חיל-ההים הבריטי מהווה רכיב מרכזי בדירוג של ras/מק מ, אשר משדרים אות מראס כדי להפעיל את מיאוגן-פרוטאין קינאז (מק ג)1,2,3,4. משפחה זו של קינסים משחק תפקיד מכריע צמיחת תאים, הישרדות ובידול, ושינויים שלהם לגרום למחלות רבות, בעיקר סרטן5,6,7,8. לאחרונה, הסקוויה גנומית זיהה מוטציות רבות הקשורות למחלות חיל הים המוצג מאפיינים שונים בשידורי האות של ראס/מט/מק/שמונה מדורגת9,10,11. אפיון קפדני של מוטציות החיל הרחב יעזור לנו להבין את המנגנונים המולקולריים של כיצד מוטציות חיל הדרכים לשנות את תפוקת האות של RAS/הפלא/מק/לבין המפל, בסופו של דבר לבחור גישות מתאימות לטיפול במחלות שונות בעלי מוטציות של חיל הים.
כולל שלושה חברים, craf, braf, ו araf, אשר יש מבנים מולקולריים דומים אבל יכולות שונות כדי להפעיל את הזרם איתות1,2,3,4. בקרב הפראלוגים הללו, בראב יש את הפעילות הגבוהה ביותר בזכות המוסריות החוקתית של נ. ת. ע. (N–tמ acidic)12,13,14, בעוד araf יש את הנמוך ביותר פעילות הנובעת מוטיב APE לא קאנוני15. זה עשוי להסביר את תדרי מוטציה שונים של חיל הים paralogs במחלות: BRAF > CRAF > ARAF. יתר על כן, בתוך אותו paralog החיל המלכותי הבריטי, מוטציות באתרים שונים עלולים לעורר אותות במורד הזרם באופן מובהק, אשר מוסיף שכבת מורכבות נוספת לוויסות משפחת חיל-החוץ. מחקרים שנעשו לאחרונה הוכיחו כי כל מדעי החיל יש הן קטליטי ו אלוסטריה פעילויות13,14,16,17,18. מוטציות של חיל-הקצה הפעיל מבחינה חוקתית מפעילים את המטה איתות ישירות על-ידי מק זרחנית, בעוד שמוטציות מסוג קינאז-מתים מסוגלים להפעיל את עמיתיהם הפראיים באמצעות הדימריזציה מצד לצד ולהפעיל איתות של מק-טיפשה באורך16 ,19,20. האהדה והיציבות של דימר הוא פרמטר מפתח שלא רק קובע את הפעילות האלומית של המוטציות המתות-מוות של קינאז, אלא גם משפיע על הפעילות הקטליטית של מוטציות מוטאיות באופן קונסטיטואליות15,21, 22. המוטנטים בעלי החיים המתים בקינאז עם זיקה דימר גבוהה/יציבות יכולים להפעיל את הרדוגני בעלי סוג פראי באופן ישיר15, בעוד אלה עם זיקה דיימר ביניים/יציבות דורש תיאום של ראס פעיל או מ רמה גבוהה של מולקולות חיל הפרא מסוג פראי לתפקד13,15,20,21,23. באופן דומה, המוטנטים הפעילים ביותר של חיל-החוץ הינם בעלי התלות העצמית של המאה התשעים, ואלה עם אהדה מזיקה נמוכה/יציבות מאבדים את פעילות הקטליטית שלהם בimmunoprecipitation שוברת את החלשים של חיל הה14, 21,22. הזיקה הדימאר/יציבות קובעת גם את רגישות המוטציות של חיל ה, המוטאנטים, ומהווה באופן חיובי את העמידות של מעכבי החיל המלכותי24. לכן, כדי לאפיין את המוטציות הקשורות במחלות, יש למדוד את פעילותם הקטליטית והאלוסטרואית, ואהדה ויציבות.
בשנים האחרונות, המעבדה שלנו ואחרים פיתחו שיטות שונות כדי לאפיין את הקינטיות של משפחת חיל הו ואת המוטציות שלהם. על-פי המעבדה שלנו והניסיון של אחרים, אנו סבורים ששלושת הנושאים הבאים מחייבים יתרונות בהגדרת מוטציות של חיל-החוץ הבריטי: (1) בשיטת הספז שניתן לבצע בקלות כדי לזהות את הפעילות הקטליטית של החוקה המוטנטים הפעילים בחיל המלכותי15; (2) הפעלה משותפת שיתוף הפעולה הינה שיטה אמינה ונוחה כדי למדוד את הפעילות אלוסטריה של המוטנטים המתים של קינאז,13,15,21,22,23, עשרים וחמש; (3) מפוצל לוציפראז מפוצלת שהוא בעל רגישות גבוהה הרבה יותר במדידת אהדה דיימר יחסי/יציבות של מוטציות חיל ההים הבריטי בניגוד לimmunoprecipitation המסורתית שיתוף, והוא מסוגל לבצע ללא ציוד מתקדם ב בניגוד לשיטות אנליטיות כמותיים כגון spr (Surface Pלזניה Resonance) ניתוח15,22. שילוב שלושת הנושאים האלה, אנו יכולים להבין בקלות כיצד מוטציה הקשורות במחלות חיל הזרם משנה את איתות במורד ובכך לנצל את האסטרטגיה הטיפולית המתאימה לטיפול במחלה הנגרמת על ידי המוטציה הזאת חיל הים.
במאמר זה, הצגנו שלוש שיטות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות, אשר כוללות את שיטת הפעולה הבין-גופית, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי ושיטת לוציפראז מפוצלת בחינם. מאז חיל הים הבריטי יש גם פעילות קטליטית ו אלוסטריה פעילות, מוטציות מסוגים שונים של חיל הים יכול להפעיל את הזרם איתות דרך שני מנגנ?…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להכיר את המענק לוקמיה של תאים שעירים לתמיכה של יואן Jimin. עבודה זו נתמכה על ידי אסיה קרן מחקר הסרטן (AFCR2017/2019-JH), דוכס-נוס Khoo גשר מימון פרס (דוכס-נוס-KBrFA/2018/0014), מענק הגישור של NCFF (NCCRF YR2018-יולי-BG4), המענק של NCCRF מענק (NCCRF YR2017-יולי-PG3), ו- מענק מחקר (AM/TP011/2018).
anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |