Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve tamamlayıcı Split Lusiferaz assay dahil raf aile kinazları, hastalık ile ilgili mutantlar karakterize için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi sundu.
Hızla hızlandırılmış Fibrosarkom (RAF) aile kinazları hücre biyolojisinde merkezi bir rol oynamaktadır ve bunların fonksiyon bozukluğu kanserler ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Hastalık ile ilgili RAF mutantlarının bir karakterizasyonu, bu hastalıkların tedavisinde uygun terapötik stratejileri seçmemize yardımcı olacaktır. Son çalışmalar RAF aile kinazların hem katalizör ve allosterik faaliyetler, sıkı dimerization tarafından düzenlenmiş olduğunu göstermiştir. Burada, katalitik ve allosterik faaliyetleri ve RAF ailesinin kinazlarının ve mutantların bağıl dimer yakınlık/stabilitesi belirlemek için pratik ve uygulanabilir Yöntemler bir dizi inşa ettik. Öncelikle, biz tampon deterjan konsantrasyonu azaltarak klasik in vitro kinaz tahlil değiştirildi, nazik bir hızlı yıkama prosedürü kullanarak, ve bir glutatyon S-transferase (GST) füzyon sırasında bunalımları raf dimerleri önlemek için istihdam Arıtma. Bu da bize, kurucu aktif RAF mutantların katalitik aktivitesini uygun şekilde ölçmemizi sağlar. İkincisi, biz bir roman raf Co-aktivasyon assay N-terminal kesilmiş raf proteinleri kullanarak kinaz-ölü raf mutantlar allosterik etkinliğini değerlendirmek için geliştirilen, geçerli protokollerde aktif RAS gereksinimini ortadan kaldırarak ve böylece daha yüksek bir elde Duyarlılık. Son olarak, biz kantitatif bağıl dimer yakınlık ölçmek için benzersiz bir tamamlayıcı bölünmüş Lusiferaz tahlil oluşturulan/çeşitli raf mutantların istikrar, hangi daha güvenilir ve duyarlı geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil kıyasla. Özetle, bu yöntemlerin aşağıdaki avantajları vardır: (1) Kullanıcı dostu; (2) gelişmiş ekipman olmadan etkili bir şekilde yürütmek mümkün; (3) maliyet-etkili; (4) son derece hassas ve yeniden oluşturulabilir.
Raf aile kinazları RAS/raf/mek/erk sinyalizasyon Cascade, Mitojen aktif protein kinaz (mek)1,2,3,4etkinleştirmek için RAS bir sinyal iletme önemli bir bileşenidir. Bu kinazlar ailesi hücre büyüme, hayatta kalma ve farklılaşma önemli bir rol oynar, ve onların değişiklikler birçok hastalık neden, özellikle kanser5,6,7,8. Son zamanlarda, genomik sequencings RAS/raf/mek/erk Cascade9,10,11sinyal iletimi farklı özellikleri sergiler birçok hastalık ile ilgili raf mutantlar belirledi. RAF mutantların dikkatli bir karakterizasyonu bize RAF mutantların RAS/RAF/MEK/ERK Cascade sinyal çıkışını değiştirmek nasıl moleküler mekanizmaları anlamak yardımcı olacaktır, sonunda çeşitli RAF mutant odaklı hastalıklar tedavisinde uygun yaklaşımlar seçin.
RAF aile kinazlar üç üye içerir, CraF, BRAF, ve Araf, benzer moleküler yapıları ama farklı yetenekleri olan1,2,3,4sinyalizasyon akış etkinleştirmek için. Bu paraloglar arasında, BRAF onun kurucu fosforile NTA (N–tTerminal acidic) Motif tarafından en yüksek aktivite vardır12,13,14, Araf en düşük sahip iken , standart olmayan APE motif15‘ den kaynaklanan aktivite. Bu hastalıklarda RAF paralogları farklı mutasyon frekansları açıklayabilir: BRAF > CRAF > ARAF. Dahası, aynı RAF paralog içinde, farklı sitelerde mutasyonlar, RAF ailesinin kinazlarının düzenlenmesi için karmaşıklık başka bir katman ekler ayrı görgü, akış sinyalizasyon tetikleyebilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar tüm raf kinlerinin katalitik ve allosterik faaliyetlere sahip olduğunu göstermiştir13, 14,16,17,18. Yapıcı aktif RAF mutantları, doğrudan fosforlama MEK tarafından geri akış sinyallerini açmak, kinaz ölü RAF mutantlar yan yana dimerization aracılığıyla vahşi tip meslektaşları transactivate ve Me-ERK sinyalizasyon aktive edebilirsiniz16 ,19,20. Dimer yakınlık/kararlılık sadece kinaz ölü raf mutantların allosterik etkinliğini belirler değil, aynı zamanda kurucu aktif raf mutantların katalitik etkinliğini etkileyen bir anahtar parametresidir15,21, 22. kinaz-ölü raf mutantlar yüksek dimer benzeşimi/stabilitesi ile doğrudan endojen vahşi tip RAFs transactivate olabilir15, ara dimer yakınlık ile olanlar/istikrar aktif RAS veya bir koordinasyon gerektirir 13,15,20,21,23işlevi için vahşi tip raf moleküllerinin yüksek düzeyde. Benzer şekilde, bir dimer bağımlı şekilde kurucu aktif raf mutantlar fosforylate mek, ve düşük dimer yakınlık/stabilitesi olan zayıf raf dimerleri tatili immünoprecipitation üzerine kendi katalitik etkinliğini kaybetmek15, 21,22. Dimer benzeşimi/kararlılık da kendi inhibitörleri için RAF mutantların duyarlılığı belirler ve pozitif RAF inhibitörleri direnci ile ilişkilidir24. Bu nedenle, hastalıkla ilgili RAF mutantlarını karakterize etmek için Katalitik ve allosterik aktivitelerini ve dimer yakınlık/stabilitesini ölçmek gerekir.
Son yıllarda, laboratuar ve diğerleri RAF aile kinazlar ve mutantları karakterize etmek için çeşitli yöntemler geliştirdik. Laboratuvarımıza ve başkalarının deneyimlerine göre, aşağıdaki üç testin hastalık ile ilgili RAF mutantları tanımlamada avantajları olduğunu düşünüyoruz: (1) kurucu katalitik etkinliğini algılamak için kolaylığı ile gerçekleştirilebilir in vitro kinaz tahlil aktif RAF mutantlar15; (2) kinaz-ölü raf mutantların allosterik etkinliğini ölçmek için güvenilir ve uygun bir yöntemdir raf Co-aktivasyon assay13,15,21,22,23, 25; (3) geleneksel Co-immünoprecipitation tahlil karşıt olarak raf mutantların bağıl dimer benzeşimi/istikrar ölçümünde çok daha yüksek hassasiyete sahip ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil, ve gelişmiş ekipman olmadan yürütmek mümkün SPR (SUrface Plasmon Resonance) analizi15,22gibi nicel analitik yöntemlerle kontrast. Bu üç asder birleştiren, biz kolayca nasıl bir hastalık ile ilgili RAF mutant akış sinyalizasyon değiştirir ve böylece bu RAF mutasyonu nedeniyle hastalığı tedavi etmek için uygun bir terapötik strateji yararlanmak anlayabiliriz.
Bu yazıda, içinde vitro kinaz assay, raf Co-aktivasyon tahlil ve ücretsiz bölünmüş Lusiferaz tahlil dahil hastalık ile ilgili raf mutantlar, karakterize etmek için üç yöntem sundu. Raf kinazları hem katalitik aktivite ve allosterik aktivite olduğundan, çeşitli raf mutantlar iki farklı mekanizmalar aracılığıyla akış sinyalizasyon aktive edebilir13,14,16,17, <sup…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Yuan Jimin desteği için Tüylü hücre lösemi Bursu kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Asya Fonu kanser Araştırması (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS KBrFA/2018/0014), NCCRF köprüleme hibe (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot hibe (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) ve SHF akademik tıp tarafından desteklenmektedir Araştırma hibe (AM/TP011/2018).
anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |