تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة
Summary
في هذه المقالة، قدمنا مجموعة من الطرق العملية والعملية لوصف المتحولين ذات الصلة بالأمراض من kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، ومختبر التنشيط المشترك، وتكملة الانقسام لوسيفيراز اختبار.
Abstract
تلعب الكينازات العائلية السريعة التسارع (RAF) دوراً محورياً في بيولوجيا الخلايا ويؤدي اختلالها الوظيفي إلى السرطانات واضطرابات النمو. ومن شأنه أن يساعدنا توصيف المتحولين المرتبطين بالأمراض في سلاح الجو الملكي البريطاني على اختيار الاستراتيجيات العلاجية المناسبة لعلاج هذه الأمراض. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني لها أنشطة حفازة وأنشطة ألوستريك على حد سواء، والتي يتم تنظيمها بإحكام من خلال التمتميّز. هنا، قمنا ببناء مجموعة من الأساليب العملية والعملية لتحديد الأنشطة الحفازة وallosteric والتقارب/الاستقرار الخافت النسبي لقرابة أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ومسوخهم. أولا، قمنا بتعديل اختبار كيناز الكلاسيكية في المختبر عن طريق الحد من تركيز المنظفات في المخازن المؤقتة، وذلك باستخدام إجراء غسل سريع لطيف، واستخدام الجلوتاثيون S-transferase (GST) الانصهار لمنع الدمامل RAF من التفكك خلال تنقيه. وهذا يمكننا من قياس النشاط الحفاز للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشط بشكل مناسب. ثانيا، قمنا بتطوير جديد سلاح الجو الملكي البريطاني في التفعيل المشترك لتقييم النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني ميتا كيناز باستخدام N-محطة اقتطاع البروتينات سلاح الجو الملكي البريطاني، والقضاء على متطلبات راس نشطة في البروتوكولات الحالية وبالتالي تحقيق أعلى حساسيه. وأخيراً، قمنا بتوليد عملية مسح منفصلة فريدة من نوعها لقياس التقارب/الاستقرار النسبي للمتحولين في سلاح الجو الملكي البريطاني، وهو أكثر موثوقية وحساسية مقارنة بالفحص التقليدي للمناعة. وباختصار، فإن هذه الأساليب لها المزايا التالية: (1) سهلة الاستخدام؛ (2) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام (2) قادرة على تنفيذ فعال دون معدات متقدمة؛ (3) فعالة من حيث التكلفة؛ (4) حساسة للغاية واستنساخها.
Introduction
وkinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني هي عنصر رئيسي من RAS / RAF / MEK / ERK إشارة تتالي، والتي تنقل إشارة من RAS لتنشيط كيناز البروتين المنشط ميثوجن (MEK)1،2،3،4. هذه الأسرة من kinases تلعب دورا حاسما في نمو الخلايا والبقاء على قيدالحياة والتمايز، وتعديلاتها تحفز العديد من الأمراض، ولا سيما السرطان 5،6،7،8. في الآونة الأخيرة، حددت التسلسلات الجينية العديد من المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض التي تظهر خصائص مختلفة في انتقال إشارة RAS / RAF / MEK / ERK شلال9،10،11. وصف دقيق لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني سوف تساعدنا على فهم الآليات الجزيئية لكيفية تغيير المتحولين RAF الناتج إشارة من RAS / RAF / MEK / ERK تتالي، في نهاية المطاف اختيار النهج المناسبة لعلاج مختلف الأمراض التي يحركها RAF متحولة.
وتشمل أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ثلاثة أعضاء، CRAF، BRAF، وARAF، والتيلديها هياكل جزيئية مماثلة ولكن قدرات مختلفة لتنشيط المصب إشارة 1،2،3،4. من بين هذه paralogs، BRAF لديها أعلى نشاط بحكم الفسفوريةالمكونة لها NtA (N –terminal acidic) عزر12،13،14،في حين أن ARAF لديه أدنى النشاط الناشئ عن عزر ها غير الكنسي APE15. وهذا قد يفسر ترددات الطفرة المختلفة من PARALOGS RAF في الأمراض: BRAF>CRAF>ARAF. وعلاوة على ذلك، فإن الطفرات في مواقع مختلفة، في إطار نفس paralog RAF، قد تؤدي إلى إشارات في المصب بطريقة متميزة، مما يضيف طبقة أخرى من التعقيد إلى تنظيم الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن جميع kinases RAF لديها كل من الأنشطة الحفازة وallosteric13،14،16،17،18. يقوم متحولو سلاح الجو الملكي البريطاني النشطون بشكل تأسيسي بتشغيل الإشارات إلى المصب مباشرة عن طريق الفسفوريلات MEK، في حين يمكن لمسوخي سلاح الجو الملكي البريطاني الميتين تحويل نظرائهم من النوع البري من خلال التمتميّز من جانب إلى جنب وتفعيل إشارة MEK-ERK16 ،19،20. التقارب/ الاستقرار هو المعلمة الرئيسية التي لا تحدد فقط النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت ولكن أيضا يؤثر على النشاط الحفاز من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة المكونة15،21، 22.يمكن للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت مع تقارب ديمر عالية / الاستقرار تحويل RAFs البرية من نوع الذاتية مباشرة15، في حين أن تلك مع تقارب ديمر المتوسطة / الاستقرار يتطلب تنسيق راس نشطة أو مستوى مرتفع من جزيئات سلاح الجو الملكي البريطاني من النوع البري لتعمل13،15،20،21،23. وبالمثل، فإن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل تأسيسي فوسفوريلات MEK بطريقة تعتمد على ديمر، وأولئك الذين يعانون من انخفاض التقارب/الاستقرار الخافت يفقدون نشاطهم الحفاز في المختبر على الترسيب المناعي الذي يكسر ضعف سلاح الجو الملكي البريطاني15، 21،22. كما يحدد التقارب/الاستقرار الخافت حساسية متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني لمثبطاتهم، ويرتبط بشكل إيجابي بمقاومة مثبطات سلاح الجو الملكي البريطاني24. ولذلك، لتوصيف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، فمن الضروري لقياس أنشطتهم الحفازة واللوستريك، وتقارب/استقرار خافت.
في السنوات الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا وغيرها من الطرق المختلفة لتوصيف kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين بهم. وفقا لمختبرنا وتجربة الآخرين، ونحن نعتقد أن الاختبارات الثلاثة التالية لها مزايا في تعريف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض: (1) اختبار كيناز في المختبر التي يمكن تنفيذها بسهولة للكشف عن النشاط الحفاز من المكونة نشط [رف] متحولات15; (2) وسلاح الجو الملكي البريطاني المشاركة في تفعيل التقوله الذي هو وسيلة موثوقة ومريحة لقياس النشاط اللوستريك من kinase القتلى RAF متحولين13،15،21،22،23، 25; (3) الفحص لوسيفيراز الانقسام المجاني الذي لديه حساسية أعلى بكثير في قياس تقارب والاستقرار قاتمة نسبيا من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني على النقيض من الفحص التقليدي المشترك للمناعة، وقادرة على تنفيذ دون معدات متقدمة في على النقيض من الأساليب التحليليةالكمية مثل SPR (S urface Plasmon Resonance) تحليل15،22. الجمع بين هذه الاختبارات الثلاثة، يمكننا أن نفهم بسهولة كيف أن متحولة RAF ذات الصلة بالأمراض يغير الإشارات المصب وبالتالي استخدام استراتيجية علاجية مناسبة لعلاج المرض الناجم عن هذه الطفرة RAF.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، قدمنا ثلاث طرق لوصف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، وسلاح الجو الملكي البريطاني اختبار التنشيط المشترك، ومجانية انقسام لوسيفيراز اختبار. وبما أن كيناز سلاح الجو الملكي البريطاني لها نشاط حفاز ونشاط أللوستريك على حد سواء، يمكن لمختلف ا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن يعترفا بزمالة سرطان الدم في الخلايا المشعرة لدعم يوان جيمين. وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق آسيا لبحوث السرطان (AFCR2017/2019-JH)، وجائزة دوك-نوس خو لجسر التمويل (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014)، والمنحة الانتقالية لـ NCCRF (NCCRF-YR2018-JUL-BG4)، والمنحة التجريبية لـ NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3)، والطب الأكاديمي SHF منحة بحثية (AM/TP011/2018).
Materials
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
Riferimenti
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
- Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 “kinase”. FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
- Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
- Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
- Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
- McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
- Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
- Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
- Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
- Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
- Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
- Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
- Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
- Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
- Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
- Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
- Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
- Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
- Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
- Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
- Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
- Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
- Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
- Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
- Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Ricerca sul cancro. 61 (9), 3595-3598 (2001).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
- Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, 289-305 (2000).
- Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. “RAF” neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
- García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
- Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
- Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
- Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).
