In questo articolo, abbiamo presentato una serie di metodi pratici e fattibili per caratterizzare i mutanti correlati alla malattia delle chinasi della famiglia RAF, che includono il saggio in vitro chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso complementare.
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Articolo metodologico
Caratterizzare i mutanti correlati alla malattia di RAF Family Kinases utilizzando una serie di metodi pratici e fattibili
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le chinasi della famiglia fibrosarcoma (RAF) rapidamente accelerato svolgono un ruolo centrale nella biologia cellulare e la loro disfunzione porta a tumori e disturbi dello sviluppo. Una caratterizzazione dei mutanti RAF correlati alla malattia ci aiuterà a selezionare strategie terapeutiche appropriate per il trattamento di queste malattie. Recenti studi hanno dimostrato che le retisi familiari della RAF hanno attività sia catalitiche che allosteric, che sono strettamente regolate dalla dimerizzazione. Qui, abbiamo costruito una serie di metodi pratici e fattibili per determinare le attività catalitiche e allosteric e la relativa affinità/stabilità di dimero delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti. In primo luogo, abbiamo modificato il classico saggio in vitro della chinasi riducendo la concentrazione di detergenti nei tamponi, utilizzando una delicata procedura di lavaggio rapido e impiegando una fusione di glutathione S-transferase (GST) per evitare che i dimeri della RAF si dissocino durante Purificazione. Questo ci permette di misurare l'attività catalitica dei mutanti RAF, in modo virile mente attivo. In secondo luogo, abbiamo sviluppato un nuovo saggio di co-attivazione della RAF per valutare l'attività allostricale dei mutanti NAsie-morti della RAF utilizzando proteine RAF troncate N-terminal, eliminando il requisito di Ras attivo nei protocolli attuali e ottenendo così un livello superiore sensibilità. Infine, abbiamo generato un unico test di lucidferasi diviso complementare per misurare quantitativamente l'affinità/stabilità relativa dei dimeri di vari mutanti RAF, che è più affidabile e sensibile rispetto al tradizionale test di co-immunoprecipitazioni. In sintesi, questi metodi presentano i seguenti vantaggi: (1) user-friendly; (2) in grado di effettuare efficacemente senza attrezzature avanzate; (3) conveniente; (4) altamente sensibili e riproducibili.
Introduzione
Le chinasi della famiglia RAF sono un componente chiave della cascata di segnalazione RAS/RAF/MEK/ERK, che trasmette un segnale da RAS per attivare la proteina mitogen -linse (MEK)1,2,3. Questa famiglia di chinasi svolge un ruolo cruciale nella crescita cellulare, sopravvivenza e differenziazione, e le loro alterazioni inducono molte malattie, in particolare il cancro5,6,7,8. Recentemente, i sequenziature genomiche....
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Protocollo
1. In Vitro Kinase Saggio per misurare l'attività catalitica dei mutanti RAF
- Costruire vettori codificano i mutanti RAF (Figura1A) con il tag FLAG(DYKDDDDK) al capointroduzione utilizzando Gibson Assembly o i metodi tradizionali di clonazione molecolare.
- Introdurre il tag FLAG e le mutazioni nelle sequenze di codifica RAF dei PCR, quindi inserire intere sequenze nel vettore pCDNA3.1() utilizzando l'assemblaggio Gibson o la legatura del DNA T4 e seguendo i protocolli del manichino. Utilizzare le seguenti condizioni per le reazioni PCR: (1) 95 gradi centigradi, 2 min; (2) 95 gradi centigradi, 30 s; (3) 5....
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Risultati
Le retine della famiglia RAF hanno attività sia catalitiche che allosteric, che consentono ai loro mutanti correlati alla malattia di attivare la segnalazione a valle attraverso diversi meccanismi13,14,16,17 ,18. I mutanti della RAF, attivi direttamente, trapolano i loro substrati, mentre i mutanti RAF morti di chinasi compiono la loro funzione trasattivando .......
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Discussione
In questo articolo, abbiamo presentato tre metodi per caratterizzare i mutanti RAF correlati alla malattia, che includono il saggio in vitro della chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso gratuito. Dal momento che le chinasi RAF hanno sia attività catalitica che attività allosteric, vari mutanti RAF possono attivare la segnalazione a valle attraverso due meccanismi distinti13,14,16,
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere la Hairy Cell Leukemia Fellowship per il supporto di Yuan Jimin. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), sovvenzione pilota NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) e SHF Academic Medicine Borsa di ricerca (AM/TP011/2018).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anti-fosfoERK1/2 | Tecnologie di segnalazione cellulare | 4370 | |
| anti-fosphoMEK1/2 | Tecnologie di segnalazione cellulare | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonale | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Tecnologie di segnalazione cellulare | 9124 | |
| anti-FLAG (mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Coniglio) | Tecnologie di segnalazione cellulare | 14793 | |
| anti-β-actina | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-coniugato anti-topo IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-coniugato anti-Coniglio IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1 (+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligasi | New England Biolabs | M0202 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM senza rosso fenolo | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferina | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-taged MEK1 (K97A) | preparati nei nostri precedenti studi | N.A. | Riferimento 15. |
| Sistema di rilevamento GloMax-Multi. | Promega | E7041 |
Riferimenti
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
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Ristampe e permessi
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