माइक्रोइंजेक्शनिंग का उपयोग करके मानव हेला कोशिकाओं में स्प्लेकोसोमल स्एनआरएन स्थानीयकरण का विश्लेषण
Summary
स्प्लेयोसोमल एसएनआरए के जीवजनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें विभिन्न सेलुलर डिब्बे शामिल होते हैं। यहाँ, हम सेल के अंदर उनके परिवहन की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट लेबल srnAs के माइक्रोइंजेक्शन कार्यरत हैं।
Abstract
स्प्लेयोसोमल एसएनआरए का जीवजनन एक जटिल प्रक्रिया है जिसमें परमाणु और कोशिकाद्रव्यदोनों दोनों चरण शामिल होते हैं और अंतिम चरण काजल शरीर नामक परमाणु डिब्बे में होता है। हालांकि, इस subnuclear संरचना में प्रत्यक्ष snRNA स्थानीयकरण अनुक्रम हाल तक ज्ञात नहीं किया गया है. काजल निकायों में srnAs के संचय के लिए महत्वपूर्ण दृश्यों का निर्धारण करने के लिए, हम fluorcently लेबल snRNAs के माइक्रोइंजेक्शन कार्यरत कोशिकाओं के अंदर उनके स्थानीयकरण के बाद. सबसे पहले, हम snRNA विलोपन म्यूटेंट तैयार, इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए संश्लेषित डीएनए टेम्पलेट्स और ALEXA488 के साथ युग्मित यूटीपी की उपस्थिति में snRNAs टाइप. लेबलित srnAs के साथ मिश्रित किया गया 70 kDa-Dextran TRITC के साथ संयुग्मी, और नाभिक या मानव Hela कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य के लिए microined. कोशिकाओं के लिए incubated थे 1 ज और तय है और काजल शरीर मार्कर coilin अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा कल्पना की गई थी, जबकि srnAs और डेक्सट्रान, जो परमाणु या कोशिका द्रव्य ीय इंजेक्शन के एक मार्कर के रूप में कार्य करता है, सीधे एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया गया. इस विधि कैसे विभिन्न दृश्यों कोशिकाओं के अंदर आरएनए स्थानीयकरण को प्रभावित के कुशल और तेजी से परीक्षण के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम काजल शरीर में snRNAs के कुशल स्थानीयकरण के लिए Sm बाध्यकारी अनुक्रम के महत्व को दिखाने के.
Introduction
आरएनए splicing जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण चरणों में से एक है, जो एक बड़े ribonucleoप्रोटीन परिसर द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है spliceosome कहा जाता है. कुल में, 150 से अधिक प्रोटीन और 5 छोटे परमाणु आरएनए (srnAs) splicing मार्ग के विभिन्न चरणों में spliceosome में एकीकृत कर रहे हैं. U1, U2, U4, U5 और U6 snRNAs प्रमुख GU-AG introns के splicing में भाग ले रहे हैं. इन snRNAs पूर्व गठन छोटे परमाणु ribonucleoप्रोटीन कणों (srnPs) कि snRNA होते हैं के रूप में spliceosome में शामिल होने, सात Sm प्रोटीन snRNA के साथ जुड़े (या की तरह एस एम प्रोटीन, जो U6 snRNA के साथ संबद्ध) और 1-12 प्रोटीन प्रत्येक snRNP के लिए विशिष्ट.
snRNPs की विधानसभा कोशिकाद्रव्यी और परमाणु चरणों शामिल है. नव लिखित SnRNA कोशिका द्रव्य जहां यह सात एस एम प्रोटीन से इकट्ठे एक अंगूठी प्राप्त करने के लिए निर्यात किया जाता है। Sm अंगूठी बाद में snRNA फिर से आयात के लिए एक संकेत के रूप में कार्य करता है नाभिक के लिए वापस. दोषपूर्ण srnAs कि Sm प्रोटीन के साथ संबद्ध करने में विफल कोशिका द्रव्य1में बनाए रखा जाता है. नव आयातित srnPs पहले काजल शरीर में दिखाई देते हैं, जहां वे snRNP विशेष प्रोटीन से मिलने और उनकी परिपक्वता खत्म (संदर्भ में समीक्षाकी 2,3). हमने हाल ही में यह दिखाया है कि अंतिम परिपक्वता के कदमों के अवरोध के परिणामस्वरूप काजल निकायों4,5में अपरिपक्व एसएनआरपी को अलग कर दिया गया है . हम एक मॉडल जहां अंतिम srnP परिपक्वता गुणवत्ता नियंत्रण है कि snRNP विशेष प्रोटीन और सक्रिय srnPs के गठन के अलावा पर नज़र रखता है के तहत है का प्रस्ताव रखा. हालांकि, कैसे कोशिकाओं को सही ढंग से इकट्ठा परिपक्व और aberant अपरिपक्व कणों के बीच भेद के आणविक विवरण मायावी रहते हैं.
परमाणु काजल निकायों में snRNAs के लक्ष्य और संचय के लिए आवश्यक हैं कि snRNA दृश्यों का निर्धारण करने के लिए, हम फ्लोरोसेंट लेबल srnAs के microinctions को रोजगार का फैसला किया. माइक्रोइंजेक्शन पसंद की एक विधि थी क्योंकि: 1) यह सिंथेटिक srnRNAs उनके अंतर्जात समकक्षों जो विशेष रूप से अतिरिक्त टैग अनुक्रम की प्रविष्टि के लिए कम स्थान के साथ कम RNAs के लिए महत्वपूर्ण है फार्म भेद करने के लिए एक अतिरिक्त अनुक्रम टैग की आवश्यकता नहीं है; 2) यह दृश्यों कि biogenesis के लिए महत्वपूर्ण हैं के विश्लेषण की अनुमति देता है. उदाहरण के लिए, Sm अनुक्रम Sm अंगूठी विधानसभा के लिए आवश्यक है और नाभिक6में फिर से आयात. जब srnAs सेल में व्यक्त कर रहे हैं, srnAs Sm अनुक्रम की कमी कोशिका द्रव्य में निम्नीकृत कर रहे हैं और नाभिक और काजल निकायों7तक नहीं पहुँच. हालांकि, SnRNAs Sm अनुक्रम के बिना सीधे नाभिक में microinsed किया जा सकता है और इस प्रकार काजल शरीर स्थानीयकरण परख में Sm अनुक्रम की एक संभावित भूमिका.
यहाँ, हम विस्तार से एक माइक्रोइंजेक्शन विधि है कि हम काजल शरीर5में snRNAs लक्ष्य के लिए आवश्यक snRNA दृश्यों का निर्धारण करने के लिए आवेदन का वर्णन. हमने दिखाया कि Sm और SMN बाध्यकारी साइटों को एक साथ आवश्यक हैं और न केवल srnAs लेकिन विभिन्न छोटे गैर-कोडिंग आरएनए काजल शरीर में स्थानीयकरण करने के लिए पर्याप्त हैं। माइक्रोइंजेक्शनिंग के साथ-साथ अन्य साक्ष्यके आधार पर, हमने प्रस्ताव किया कि Sm बाइंडिंग साइट पर इकट्ठे हुए Sm अंगूठी काजल शरीर स्थानीयकरण संकेत है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने परमाणु काजल निकायों में एनआरएनए स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण दृश्यों का निर्धारण करने के लिए फ्लोरोसेंट लेबल वाले snRNAs का माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग किया। लेबल आरएनए की तेजी से और बल्कि सरल तैयारी …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चेक साइंस फाउंडेशन (18-10035S), राष्ट्रीय स्थिरता कार्यक्रम मैं (LO1419), संस्थागत सहायता (RVO68378050), यूरोपीय क्षेत्रीय विकास कोष (C$.02.1.01/0.0/0.0/16]013/001775) और अनुदान एजेंसी द्वारा समर्थित किया गया था चार्ल्स विश्वविद्यालय (GAUK 134516). हम आगे लाइट माइक्रोस्कोपी कोर सुविधा, IMG कैस, प्राग, चेक गणराज्य (अनुदान द्वारा समर्थित (चेक-बायोइमेजिंग – LM2015062) स्वीकार करते हैं.
Materials
| ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP | ThermoFisher | C11403 | Stock concentration 1 mM |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium – high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics |
| FemtoJet express Injector | Eppendorf | 5247000013 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter |
| Fluoromont G with DAPI | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Glycogen | ThermoFisher | AM9510 | Stock concentration 5 mg/mL |
| Gridded Glass Coverslips | Ibidi | 10817 | Coverslips with a grid, no direct experience with them |
| InjectMan NI 2 Micromanipulator | Eppendorf | 5181000017 | |
| m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue | Jena Bioscience | NU-853-1 | Stock concentration 40 mM |
| MEGAshortscript T7 Transcription Kit | ThermoFisher | AM1354 | |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1 | Paul Marienfeld GmbH | 111520 | For routine work |
| Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5 | Paul Marienfeld GmbH | 117520 | For high resolution images |
| Microscope DeltaVision | GE Healthcare | For image acquisition | |
| Microscope DMI6000 | Leica | For microinjection | |
| Paraformaldehyde 32% solution EM grade | EMS | 15714 | Dissolved in PIPES to the final concentration 4% |
| Phenol:Chloroform 5:1 | Sigma-Aldrich | P1944 | |
| Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT |
Sigma-Aldrich | T7 rpromoter sequence in italics | |
| Phusion High Fidelity DNA polymerase | BioLab | M0530L | |
| RNasin Plus | Promega | N2615 | Stock concentration 40 mM |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa | Sigma-Aldrich | T1162 | Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL |
| Triton-X100 | Serva | 37240 | Dissolved in water, stock concentration 10% |
Riferimenti
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