טיהור של טסיות מתוך דם העכבר
Summary
כאן, דמו של העכבר נאסף. בנוכחות אנטי-מקריש טסיות היו מטוהרים על ידי המדיום iohexol באמצעות מהירות נמוכה צנטריפוגה. טסיות הדם הופעלו עם תרומבין. כדי לחקור אם הם היו מעשי האיכות של טסיות מטוהר נותחו על ידי cy, מיקרוסקופ זרימה.
Abstract
טסיות מטוהרים מדם שלם כדי ללמוד את המאפיינים הפונקציונליים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מתאי דם אדומים (RBC), כדוריות דם לבנות (WBC), וחלבונים פלזמה. אנו מתארים כאן טיהור של טסיות מתוך דם העכבר באמצעות שלושה מקפלים יותר מעבר מדרגה בינונית ביחס לנפח דגימת דם ו צנטריפוגה ברוטור דלי מנופף ב 400 x g עבור 20 דקות ב 20 ° c. ההתאוששות/תשואה של טסיות מטוהר היו 18.2-38.5%, ואת טסיות מטוהר היו במצב מנוחה, אשר לא מכילים כל מספר משמעותי של RBC ו-WBC. טסיות מטוהרים מטופלים עם תרומבין הגיע עד 93% הפעלה, המציין את הכדאיות שלהם. אנו מאשרים כי טסיות מטוהר הם טהורים מספיק באמצעות cytometric זרימה הערכה מיקרוסקופית. טסיות אלה ניתן להשתמש עבור ביטוי גנים, הפעלה, שחרור גרגר עושה מצבור, הדבקה assays. שיטה זו ניתן להשתמש לטיהור של טסיות מדם של מינים אחרים, כמו גם.
Introduction
טסיות הם רכיב של דם המתפקד כיוזם של קרישת דם בתגובה לנזק בכלי הדם. הם מתאספים באתר של פציעה. כדי לחבר את כלי הקיבול לקיר1 טסיות הם שברי אנוקלאט של ציטופלסמה הנגזר מהקרציטים של מח העצם תחת השפעת התרובטין ולהיכנס למחזור הדם2. הם נחשבים metabolically פעילים ומסוגלים לחוש הסביבה מסחטות על ידי הפעלת מפלי איתות תאיים כי התוצאה היא התפשטות טסיות, מצבור, ו הומוסטטית היווצרות תקע1,3. מלבד הומוסטזיס/פקקת וריפוי הפצע4, טסיות לשחק תפקיד חשוב בתגובות דלקתיות מארח, אנגיוגנזה, ו גרורות3,5,6,7, שמונה.
טסיות מטוהרים מדם ללמוד תכונות ביוכימיים ופיסיולוגיים שלהם, אשר צריך להיות חופשי מרכיבי דם אחרים. מאז כדוריות הדם האדומות (rbc) וכדוריות הדם הלבנות (wbc) מכילים באופן משמעותי יותר RNA וחלבונים מאשר טסיות9,10, נוכחות של מספר קטן של תאים אלה יכול להפריע לניתוח הטרנססקריפט והפרוטאומית של RNA וחלבונים הנגזרים מטסיות הדם. מצאנו כי טסיות מטוהרים מופעל עם נוגדנים לאגד תרומבין כגון אנטי GPIIb/IIIa (ג’ון/A) ו אנטי-P-selectin ביעילות רבה יותר מאשר טסיות דם שלמות.
מאחר שטסיות הן שבירות, חשוב לטפל בדגימות במתינות ככל האפשר. אם טסיות מופעלות, הם משחררים את תוכן הגרריר שלהם ובסופו של דבר לבזות. לכן, כדי לשמור על המאפיינים הפונקציונליים של טסיות שלמות, חשוב לשמור על השקט טסיות בזמן הבידוד. פרוטוקולים מספר תיארו בידוד של טסיות מן האדם, כלב, עכברוש, והפרימטים לא אנושיים על ידי שיטות שונות1,10,11,12. חלק מהשיטות דורשות שלבים מרובים כגון אוסף של פלזמה עשיר טסיות ידי צנטריפוגה, סינון על ידי הפרדת הטור, מבחר שלילי של טסיות עם הנוגדן הספציפי RBC-ו-WBC-מצוייחים לחרוזים מגנטיים, וכן הלאה, אשר זמן רב ועלול לבזות את הטסיות ואת תוכנם.
פורד ועמיתיו תיאר לטיהור טסיות דם אנושי באמצעות iohexol בינוני11. שיטה זו משתמשת בכמות דומה של דגימת דם ובינונית במהלך הטיהור. מאז בני האדם להניב נפח גבוה יותר של דם, קל יחסית לטהר את טסיות.
Iohexol היא צפיפות אוניברסלית מעבר הדרגתי בינונית, כי הוא מסיסים באופן חופשי במים ומשמש השבר של חומצות גרעין, חלבונים, פוליסכרידים, ו נוקלאופרוטאינים13,14. יש לו אוסמאליות נמוכה והוא לא רעיל, ובכך הופך אותו למדיום אידיאלי לטיהור של תאים חיים שלמים11. זהו מדיום שאינו חלקיקי; לפיכך, ניתן לקבוע את התפלגות התאים במעבר צבע באמצעות הומוציטומטר, הזרמת cytom, או ספקטרוסקופיה. היא אינה מפריעה לרוב התגובה האנזימטית או הכימית של התאים או החלקים הסלולריים לאחר דילול.
העכבר משמש מודל חשוב בעלי חיים עבור מחלות אנושיות רבות15,16,17,18. יש כמה מאמרים שפורסמו שמתארים טיהור של טסיות העכבר19,20. עם זאת, העכבר מניב נפח קטן יחסית של דם, מה שמקשה על טיהור טסיות. אם נעשה שימוש באותו כמות קטנה של בינוני ודגימות דם, שכבת הטסיות לא יכולה להיות מופרדת בבירור משכבת ה-RBC-WBC לאחר צנטריפוגה. במאמר זה, תיארנו שיטה מהירה ופשוטה של טיהור העכבר טסיות עם שלושה קיפול מעבר מדרגה גבוהה יותר בינונית ביחס לנפח דגימת הדם ומהירות נמוכה צנטריפוגה. בנוסף, הפעלנו את טסיות הדם הטהורה עם התרומבין וחקרו את איכותם בעזרת cy, והמיקרוסקופיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בדרך כלל, טסיות מבודדות על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה אשר מניב פלזמה עשיר טסיות המכיל מספר משמעותי של כדוריות הדם, הפסולת התאית, וחלבונים פלזמה אשר יכול להפריע הביוכימי והפיסיולוגיים והצרכים הפיזיולוגיים טיהור נוסף21. לכן, חשוב להשתמש בשיטה מהירה ופשוטה אשר יכולה להניב טסיו?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי סטארט-up מימון של הקרן המחקר של סינסינטי לילדים ואוניברסיטת סינסינטי מענק הפיילוט Translational M.N. אנחנו רוצים להודות הילדים סינסינטי בבית החולים מחקר זרימה Cy, ליבה על השירותים שלהם.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
Riferimenti
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
