Qui, il sangue del topo è stato raccolto in presenza di un anti-coagulante. Le piastrine sono state purificate dal mezzo gradiente di Ioexolo usando la centrifugazione a bassa velocità. Le piastrine sono state attivate con trombina per indagare se fossero vitali. La qualità delle piastrine purificate è stata analizzata mediante citometria a flusso e microscopia.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Purificazione delle piastrine dal sangue del topo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le piastrine vengono purificate dal sangue intero per studiare le loro proprietà funzionali, che dovrebbero essere prive di globuli rossi (RBC), globuli bianchi (WBC) e proteine plasmatiche. Descriviamo qui la purificazione delle piastrine dal sangue del topo utilizzando tre volte più Ioexolo gradiente medio rispetto al volume del campione di sangue e centrifugazione in un rotore a benna oscillante a 400 x g per 20 min a 20 ° c. Il recupero/rendimento delle piastrine purificate era 18,2-38,5%, e le piastrine purificate erano in uno stato di riposo, che non conteneva alcun numero significativo di RBC e WBC. Le piastrine purificate trattate con trombina hanno mostrato fino al 93% di attivazione, indicando la loro vitalità. Abbiamo confermato che le piastrine purificate sono sufficientemente puri utilizzando la valutazione citometria a flusso e microscopica. Queste piastrine possono essere utilizzate per l'espressione genica, l'attivazione, il rilascio del granulo, l'aggregazione e i saggi di adesione. Questo metodo può essere utilizzato per la purificazione delle piastrine dal sangue di altre specie pure.
Introduzione
Le piastrine sono un componente di sangue che funge da iniziatore della coagulazione del sangue in risposta a danni nel vaso sanguigno. Si riuniscono nel sito di lesione per collegare la parete del vaso1. Le piastrine sono frammenti anucleati di citoplasma derivati dai megacariociti del midollo osseo sotto l'influenza della trombopoietina e entrano nella circolazione2. Sono considerati metabolicamente attivi e capaci di rilevare l'ambiente extracellulare attivando le cascate di segnalazione intracellulare che provocano la diffusione piastrinica, l'aggregazione e la formazione di spine emostatiche1....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
La raccolta del sangue del topo deve essere condotta con un'adeguata assistenza istituzionale e l'approvazione del Comitato di uso.
Nota: Il protocollo di purificazione piastrinica è descritto in un diagramma di flusso in Figura 1.
1. raccolta di sangue
- Aggiungere 25 μL di 3,2% citrato di sodio (pH 7,2) come un anticoagulante e 0,4 mM di Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) in un tubo di polipropilene.
-
Raccogliere circa 200 μL di sangue dal mouse topi C57BL/6 usando un sanguinamento retro-orbitale.
Nota: il sangue può essere raccolto da qua....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Il riassunto della purificazione piastrinica è descritto in un diagramma di flusso (Figura 1). I passaggi includono la raccolta di sangue dal topo con sanguinamento retro-orbitale in presenza di un anticoagulante, aggiunta di campione di sangue sul mezzo di gradiente di ioexolo, centrifugazione in un rotore oscillante a benna a 400 x g per 20 minuti a 20 ° c. La qualità delle piastrine purificate è stata valutata con microscopia e citometria a flusso dopo colorazione con anticorpo p.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Comunemente, le piastrine sono isolate da centrifugazione a bassa velocità che produce plasma ricco di piastrine che contiene un numero significativo di cellule del sangue, detriti cellulari e proteine plasmatiche che possono interferire con i saggi biochimici e fisiologici e le esigenze ulteriore purificazione21. Pertanto, è importante utilizzare un metodo rapido e semplice che può produrre piastrine pure senza contaminanti principali. Il protocollo qui presentato descrive la purificazione delle .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di Start-up della Cincinnati Children ' s Research Foundation e da una sovvenzione traslazionale pilota dell'Università di Cincinnati a M.N. Vorremmo ringraziare il Cincinnati Children ' s Hospital Research Flow citometria core per i loro servizi.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| APC ratto anti-topo/umano CD62P (P-selectina) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Marcatore di attivazione piastrinica |
| Eppendorf tubo | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tubo per centifugo |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Articolo non di catalogo | Analisi di piastrine e sangue intero |
| tubo FACS | Fisher Scientific | 352008 | Tubi per flusso citometria |
| Siero fetale bovino (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingrediente per la colorazione del tampone |
| FITC ratto anti-topo CD41 | BD Biosciences | 553848 | Marcatore piastrinico Citometro |
| flusso | BD Biosciences | Elemento non di catalogo | Analisi delle piastrine e del sangue intero |
| Software FlowJo FlowJo | , Inc. | Voce non di catalogo | Analisi delle piastrine e del sangue intero |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevenire la formazione di coaguli piastrinici |
| Ematocrito Tubo capillare | Fisher | Scientific 22-362566 | Tubo capillare per la raccolta del sangue |
| Hemavet | Drew Scientific | Articolo non di catalogo | Analizzatore di cellule del sangue |
| Emocitometro | Hausser Scientific | 3100 | Camera di conteggio cellulare |
| Isoflurano | Baxter | 1001936040 | Utilizzare per anestetizzare il topo |
| Microscopio (Olympus CKX41) | Olympus | Articolo non di catalogo | Monitoraggio e conteggio cellulare |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE ratto anti-topo CD45 | BD Biosciences | 561087 | marcatore WBC |
| PE-Cy7 ratto anti-topo TER 119 | BD Biosciences | 557853 | marcatore RBC |
| Punte Pipet 200 µ L, a foro largo | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Trasferimento di campioni di sangue e piastrine |
| Punte per pipette 1000 &; L, a foro largo | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Trasferimento di campioni di sangue e piastrine |
| Soluzione salina potenziata con fosfato (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Tampone per lavaggio e diluizione |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S7653 | Soluzione fisiologica |
| Soluzione salina Citrato di sodio | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anticoagulante |
| Tampone di colorazione | Articolo | non di catalogo Articolo non di catalogo | Acqua di lavaggio e diluizione |
| Articolo non di catalogo | Solvente | ||
| Centrifuga da tavolo | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Centrifuga a rotore a secchiello oscillante |
| Trombina | Laboratorio di ricerca sugli enzimi | HT 1002a | Agonista dell'attivazione piastrinica |
| Tricina | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer per Nycodenz medium |
Riferimenti
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
