Purificazione delle piastrine dal sangue del topo
Summary
Qui, il sangue del topo è stato raccolto in presenza di un anti-coagulante. Le piastrine sono state purificate dal mezzo gradiente di Ioexolo usando la centrifugazione a bassa velocità. Le piastrine sono state attivate con trombina per indagare se fossero vitali. La qualità delle piastrine purificate è stata analizzata mediante citometria a flusso e microscopia.
Abstract
Le piastrine vengono purificate dal sangue intero per studiare le loro proprietà funzionali, che dovrebbero essere prive di globuli rossi (RBC), globuli bianchi (WBC) e proteine plasmatiche. Descriviamo qui la purificazione delle piastrine dal sangue del topo utilizzando tre volte più Ioexolo gradiente medio rispetto al volume del campione di sangue e centrifugazione in un rotore a benna oscillante a 400 x g per 20 min a 20 ° c. Il recupero/rendimento delle piastrine purificate era 18,2-38,5%, e le piastrine purificate erano in uno stato di riposo, che non conteneva alcun numero significativo di RBC e WBC. Le piastrine purificate trattate con trombina hanno mostrato fino al 93% di attivazione, indicando la loro vitalità. Abbiamo confermato che le piastrine purificate sono sufficientemente puri utilizzando la valutazione citometria a flusso e microscopica. Queste piastrine possono essere utilizzate per l’espressione genica, l’attivazione, il rilascio del granulo, l’aggregazione e i saggi di adesione. Questo metodo può essere utilizzato per la purificazione delle piastrine dal sangue di altre specie pure.
Introduction
Le piastrine sono un componente di sangue che funge da iniziatore della coagulazione del sangue in risposta a danni nel vaso sanguigno. Si riuniscono nel sito di lesione per collegare la parete del vaso1. Le piastrine sono frammenti anucleati di citoplasma derivati dai megacariociti del midollo osseo sotto l’influenza della trombopoietina e entrano nella circolazione2. Sono considerati metabolicamente attivi e capaci di rilevare l’ambiente extracellulare attivando le cascate di segnalazione intracellulare che provocano la diffusione piastrinica, l’aggregazione e la formazione di spine emostatiche1,3. Oltre a emostasi/trombosi e guarigione delle ferite4, le piastrine svolgono un ruolo importante nelle risposte infiammatorie dell’ospite, nell’angiogenesi e metastatis3,5,6,7, 8. il
Le piastrine vengono purificate dal sangue per studiare le loro proprietà biochimiche e fisiologiche, che dovrebbero essere libere da altri componenti del sangue. Poiché i globuli rossi (RBC) e globuli bianchi (WBC) contengono significativamente più RNA e proteine rispetto alle piastrine9,10, la presenza di anche un piccolo numero di queste cellule può interferire con le analisi trascrittomiche e proteomica di RNA e proteine derivate dalle piastrine. Abbiamo scoperto che le piastrine purificate attivate con anticorpo trombina legano come anti-GPIIb/IIIa (JON/A) e anti-P-selectin in modo più efficiente rispetto alle piastrine intere del sangue.
Poiché le piastrine sono fragili, è importante trattare i campioni nel modo più delicato possibile. Se le piastrine sono attivate, rilasciano il loro contenuto di granulo e infine degradano. Pertanto, per mantenere intatte le proprietà funzionali delle piastrine, è importante mantenere la quiescenza piastrinica durante l’isolamento. Diversi protocolli hanno descritto l’isolamento delle piastrine dal primate umano, cane, ratto e non umano con vari metodi1,10,11,12. Alcuni dei metodi richiedono più passaggi, come la raccolta di plasma ricco di piastrine mediante centrifugazione, filtrazione per colonna di separazione, selezione negativa di piastrine con RBC-e anticorpo WBC-specifico coniugato a perle magnetiche, e così via, che sono che richiedono tempo e possono degradare le piastrine e il loro contenuto.
Ford e i suoi colleghi hanno descritto la purificazione piastrinica dal sangue umano usando Ioexolo medium11. Questo metodo utilizza un volume simile di campione di sangue e mezzo durante la purificazione. Poiché gli esseri umani producono un volume più elevato di sangue, è relativamente facile purificare le piastrine.
Iohexol è un mezzo inerti a gradiente universale che è liberamente solubile in acqua e utilizzato nel frazione di acidi nucleici, proteine, polisaccaridi e nucleoproteine13,14. Ha bassa osmolalità ed è atossico, rendendolo così un mezzo ideale per la purificazione delle cellule viventi intatte11. Si tratta di un mezzo non particolato; Pertanto, la distribuzione delle cellule in un gradiente può essere determinata utilizzando l’emocytometro, il citometro di flusso o lo spettrofotometro. Non interferisce con la maggior parte della reazione enzimatica o chimica delle cellule o frammenti cellulari dopo la diluizione.
Il topo funge da modello animale importante per molte malattie umane15,16,17,18. Ci sono alcuni articoli pubblicati che descrivono la purificazione delle piastrine del topo19,20. Tuttavia, il topo produce un volume relativamente più piccolo di sangue, il che rende difficile purificare le piastrine. Se si utilizza lo stesso piccolo volume di gradiente medio e campioni di sangue, lo strato piastrinico non può essere chiaramente separato dallo strato di RBC-WBC dopo la centrifugazione. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo rapido e semplice di purificazione piastrinica del topo con tre volte più Ioexolo gradiente medio rispetto al volume del campione di sangue e centrifugazione a bassa velocità. Abbiamo anche attivato le piastrine purificate con trombina e indagato la loro qualità con citometria di flusso e microscopia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comunemente, le piastrine sono isolate da centrifugazione a bassa velocità che produce plasma ricco di piastrine che contiene un numero significativo di cellule del sangue, detriti cellulari e proteine plasmatiche che possono interferire con i saggi biochimici e fisiologici e le esigenze ulteriore purificazione21. Pertanto, è importante utilizzare un metodo rapido e semplice che può produrre piastrine pure senza contaminanti principali. Il protocollo qui presentato descrive la purificazione del…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento di Start-up della Cincinnati Children ‘ s Research Foundation e da una sovvenzione traslazionale pilota dell’Università di Cincinnati a M.N. Vorremmo ringraziare il Cincinnati Children ‘ s Hospital Research Flow citometria core per i loro servizi.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
Riferimenti
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