Fare kan trombosit arıtma
Summary
Burada, fare kanı bir anti-koagulan varlığında toplandı. Trombositler, düşük hızlı santrifüjleme kullanılarak iohexol degrade orta tarafından arındırıldı. Trombositler uygulanabilir olup olmadığını araştırmak için Trombin ile aktive edildi. Arıtılmış trombositlerin kalitesi akış sitometri ve mikroskobu ile incelendi.
Abstract
Trombositler, kırmızı kan hücrelerinden (RBC), beyaz kan hücrelerinden (WBC) ve plazma proteinlerinin serbest olması gereken fonksiyonel özelliklerini incelemek için bütün kandan arındırılır. Burada, 20 °C ‘ de 20 dakika için 400 x g ‘de bir sallanan kova rotorunda kan numunesi hacmine ve santrifüje göre üç kat daha fazla iohexol degrade orta kullanarak fare kanından trombositlerin arıtılmasını tarif ediyoruz. Arıtılmış trombositlerin iyileşme/verimi% 18,2-38,5 idi ve saf trombositler, önemli sayıda RBC ve WBC içermeyen bir dinlenme durumudur. Trombin ile tedavi edilen arıtılmış trombositler,% 93 ‘ e kadar harekete geçirmek için ortaya çıktı. Biz arıtılmış trombositlerin akış cytometrik ve mikroskobik değerlendirme kullanarak yeterince saf olduğunu doğruladı. Bu trombositler gen ifadesi, aktivasyon, granül salınımı, toplama ve yapışma uygulamaları için kullanılabilir. Bu yöntem, diğer türlerin kanından trombositlerin arıtılması için de kullanılabilir.
Introduction
Trombosit kan damarında hasar yanıt olarak kan pıhtılaşma bir başlatıcı olarak işlev kan bileşenidir. Onlar damar duvarı1takmak için yaralanma sitede toplamak. Trombosit, thrombopoetin etkisi altında kemik iliği megakaryanositlerden elde edilen Sitoplazmanın anucleate parçaları ve dolaşım2girin. Onlar metabolik olarak aktif olarak kabul edilir ve hücre içi sinyal şelaleler aktive ederek, trombosit yayma, toplama, ve hemostatik fiş oluşumu ile sonuçlanması ile hücreli dışı çevre algılama yeteneğine1,3. Hemostaz/tromboz ve yara iyileşmesi4‘ ün yanı sıra trombositler ana inflamatuar tepkiler, anjiyogenezi ve metastis3,5,6,7‘ de önemli bir rol oynamaktadır. 8‘ den itibaren.
Trombositler, diğer kan bileşenlerinden özgür olması gereken biyokimyasal ve fizyolojik özelliklerini incelemek için kandan arındırılır. Kırmızı kan hücreleri (RBC) ve beyaz kan hücreleri (WBC), trombositlerden9,10‘ a göre önemli ölçüde daha fazla RNA ve protein içerdiğinden, bu hücrelerin az sayıda varlığı bile RNA ‘nın transcriptomik ve proteomik analizlerine engel olabilir ve proteinler trombositlerden türetilmiştir. Anti-GPIIb/ııia (JON/A) ve anti-P-selectin gibi Trombin bağlama antikor ile aktif olan trombositlerin tüm kan trombositinden daha verimli bir şekilde etkinleştirildiği tespit edilmiştir.
Trombosit kırılgan olduğundan, örnekleri mümkün olduğunca hafif tedavi etmek önemlidir. Trombosit aktifleşirse, granül içeriklerini serbest bırakıyorlar ve sonunda zayıflatır. Bu nedenle, trombositlerin fonksiyonel özelliklerini bozulmamış tutmak için yalıtım sırasında trombosit sessizliği korumak önemlidir. Birçok protokol, trombositlerin insan, köpek, sıçan ve insan dışı primat ile çeşitli yöntemlerle yalıtımını1,10,11,12olarak tanımlıyor. Yöntemlerden bazıları, santrifüjleme ile trombosit açısından zengin plazma toplanması, ayırma sütununa göre filtrasyon, RBC ile trombositlerin negatif seçimi ve manyetik boncuklara konjuk edilen WBC ‘ye özgü antikor gibi birden fazla adımı gerektirir, ve benzeri, zaman alıcı ve trombositler ve bunların içeriğini düşürebilir.
Ford ve meslektaşları iohexol orta11kullanarak insan kanından trombosit arıtma nitelendirdi. Bu yöntem, arıtma sırasında benzer bir hacim kan örneği ve orta kullanır. İnsanlar kan daha yüksek bir hacim verim beri, nispeten trombosit arındırmak kolaydır.
Iohexol, su içinde serbestçe çözünür ve nüklerik asitler, proteinler, polisakkaritler ve nükroproteinler13,14kesitte kullanılan evrensel yoğunluklu gradyan inert bir ortamdır. Bu düşük osmolalitesi vardır ve toksik olmayan, böylece bozulmamış yaşam hücrelerinin arıtma için ideal bir orta yapma11. Bu bir partikül olmayan ortamdır; Bu nedenle, bir degradedeki hücrelerin dağılımı hemocytometer, Flow cytometer veya spektrofotometre kullanılarak belirlenebilir. Seyreltme işleminden sonra hücrelerin veya hücresel parçaların enzimatik veya kimyasal reaksiyonunun çoğunu engellemez.
Fare birçok insan hastalıkları için önemli bir hayvan modeli olarak hizmet vermektedir15,16,17,18. Fare trombositlerin arıtma açıklayan birkaç Yayınlanan Makaleler vardır19,20. Ancak, fare kan nispeten daha küçük bir hacim verir, bu da zor trombosit arındırmak için yapar. Aynı küçük hacim gradyan orta ve kan numuneleri kullanılırsa, trombosit tabakası Santrifüjden sonra RBC-WBC tabakasından açıkça ayrılamaz. Bu yazıda, kan numunesi hacmi ve düşük hızlı santrifüjleme göreli olarak üç kat daha iohexol degrade orta ile fare trombosit arıtma hızlı ve basit bir yöntem tarif ettik. Ayrıca, arıtılmış trombositleri Trombin ile aktive ettik ve kalitesini akış sitometri ve mikroskobik ile araştırdık.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaygın olarak, trombositler düşük hızlı santrifüjleme ile yalıtılır, bu da önemli sayıda kan hücresi içeren trombosit açısından zengin plazma verir, hücresel enkaz ve biyokimyasal ve fizyolojik tespit ve ihtiyaçlara engel olabilecek Plazma proteinleri daha fazla arıtma21. Bu nedenle, büyük kirleticiler olmadan saf trombosit verebilecek hızlı ve basit bir yöntem kullanmak önemlidir. Burada sunulan protokol, düşük hızlı santrifüjleme ile degrade bir ortam kullanarak f…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Cincinnati çocuk Araştırma Vakfı ‘nın bir başlangıç finansmanı ve mına ‘ya Cincinnati pilot translational Grant Üniversitesi tarafından destekleniyordu. Cincinnati çocuk hastanesi araştırma akışı sitometri Çekirdek Hizmetleri için teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| APC rat anti-mouse/human CD62P (P-selectin) | Thermoscientific | 17-0626-82 | Platelets activation marker |
| Eppendorf tube | Fisher Scientific | 14-222-166 | Tube for centifuge |
| FACS DIVA software | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FACS tube | Fisher Scientific | 352008 | Tubes for flow cytomtery |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 26140079 | Ingredient for staining buffer |
| FITC rat anti-mouse CD41 | BD Biosciences | 553848 | Platelets marker |
| Flow cytometer | BD Biosciences | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| FlowJo software | FlowJo, Inc. | Non-catalog item | Analysis of platelets and whole blood |
| Gly-Pro-Arg-Pro (GPRP) | EMD Millipore | 03-34-0001 | Prevent platelet clot formation |
| Hematocrit Capillary tube | Fisher Scientific | 22-362566 | Blood collection capillary tube |
| Hemavet | Drew Scientific | Non-catalog item | Blood cell analyzer |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 3100 | Cell counting chamber |
| Isoflurane | Baxter | 1001936040 | Use to Anesthetize mouse |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Nycodenz (Histodenz) | Sigma-Aldrich | D2158 | Gradient medium |
| PE rat anti-mouse CD45 | BD Biosciences | 561087 | WBC marker |
| PE-Cy7 rat anti-mouse TER 119 | BD Biosciences | 557853 | RBC marker |
| Pipet tips 200 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-1A | Transferring blood and platelet samples |
| Pipet tips 1000 µL, wide-bore | ThermoFisher Scientific | 21-236-2C | Transferring blood and platelet samples |
| Phosphate buffured saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14040-117 | Buffer for washing and dilution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | Physiological saline |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | 02-688-26 | Anti-coagulant |
| Staining buffer | In-house | Non-catalog item | Wash and dilution buffer |
| Steile water | In-house | Non-catalog item | Solvent |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | Swinging bucket rotor centrifuge |
| Thrombin | Enzyme Research Laboratoty | HT 1002a | Platelet activation agonist |
| Tricine | Sigma-Aldrich | T0377 | Buffer for Nycodenz medium |
Riferimenti
- de Witt, S. M., Verdoold, R., Cosemans, J. M., Heemskerk, J. W. Insights into platelet-based control of coagulation. Thrombosis Research. 133, S139-S148 (2014).
- Machlus, K. R., Thon, J. N., Italiano, J. E. Interpreting the developmental dance of the megakaryocyte: a review of the cellular and molecular processes mediating platelet formation. British Journal of Haematology. 165 (2), 227-236 (2014).
- Weyrich, A. S., Zimmerman, G. A. Platelets: signaling cells in the immune continuum. Trends in Immunology. 25 (9), 489-495 (2004).
- Nami, N., et al. Crosstalk between platelets and PBMC: New evidence in wound healing. Platelets. 27 (2), 143-148 (2016).
- Mancuso, M. E., Santagostino, E. Platelets: much more than bricks in a breached wall. British Journal of Haematology. 178 (2), 209-219 (2017).
- Hampton, T. Platelets’ Role in Adaptive Immunity May Contribute to Sepsis and Shock. Journals of the American Medical Association. 319 (13), 1311-1312 (2018).
- Sabrkhany, S., Griffioen, A. W., Oude Egbrink, M. G. The role of blood platelets in tumor angiogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Reviews on Cancer. 1815 (2), 189-196 (2011).
- Menter, D. G., et al. Platelet "first responders" in wound response, cancer, and metastasis. Cancer and Metastasis Reviews. 36 (2), 199-213 (2017).
- Fink, L., et al. Characterization of platelet-specific mRNA by real-time PCR after laser-assisted microdissection. Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 749-756 (2003).
- Trichler, S. A., Bulla, S. C., Thomason, J., Lunsford, K. V., Bulla, C. Ultra-pure platelet isolation from canine whole blood. BioMed Central Veterinary Research. 9, 144 (2013).
- Ford, T. C., Graham, J., Rickwood, D. A new, rapid, one-step method for the isolation of platelets from human blood. Clinica Chimica Acta. 192 (2), 115-119 (1990).
- Noisakran, S., et al. Infection of bone marrow cells by dengue virus in vivo. Experimental Hematolology. 40 (3), 250-259 (2012).
- Rickwood, D., Ford, T., Graham, J. Nycodenz: a new nonionic iodinated gradient medium. Analytical Biochemistry. 123 (1), 23-31 (1982).
- Graham, J. M., Ford, T., Rickwood, D. Isolation of the major subcellular organelles from mouse liver using Nycodenz gradients without the use of an ultracentrifuge. Analytical Biochemistry. 187 (2), 318-323 (1990).
- Milligan, G. N., et al. A lethal model of disseminated dengue virus type 1 infection in AG129 mice. Journal of General Virology. 98 (10), 2507-2519 (2017).
- Strassel, C., et al. Lentiviral gene rescue of a Bernard-Soulier mouse model to study platelet glycoprotein Ibbeta function. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (7), 1470-1479 (2016).
- Bergmeier, W., Boulaftali, Y. Adoptive transfer method to study platelet function in mouse models of disease. Thrombosis Research. 133, S3-S5 (2014).
- Bakchoul, T., et al. Recommendations for the use of the non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency mouse model in autoimmune and drug-induced thrombocytopenia: communication from the SSC of the ISTH. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (5), 872-875 (2015).
- Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. , 1-10 (2018).
- Jirouskova, M., Shet, A. S., Johnson, G. J. A guide to murine platelet structure, function, assays, and genetic alterations. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 5 (4), 661-669 (2007).
- Birschmann, I., et al. Use of functional highly purified human platelets for the identification of new proteins of the IPP signaling pathway. Thrombosis Research. 122 (1), 59-68 (2008).
