연쇄상 구균 뮤탄에서 높은 분자 질량 단백질의 정화
Summary
여기에 기재된 것은 연쇄상 구균 뮤탄에서유전자 생성물의 정제를 위한 간단한 방법이다. 이 기술은 단백질, 특히 막 단백질 및 고분자 질량 단백질의 정제에 유리할 수 있으며, 다양한 다른 세균 종과 함께 사용될 수 있다.
Abstract
유전자의 기능의 해명이 전형적으로 관심의 유전자가 중단된 야생 형 긴장 및 긴장의 표현형 형질의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 다음 기능의 손실은 이후에 중단된 유전자의 산물의 외인성 첨가에 의해 회복된다. 이것은 유전자의 기능을 결정하는 것을 돕습니다. 앞서 설명한 방법은 gtfC 유전자-중단된 연쇄상 구균 뮤탄스 균주를 생성하는 것을 포함한다. 여기서, 유전자 파괴 에 이어 새로 생성된 S. 뮤탄스 균주로부터 gtfC 유전자 생성물을 정제하기 위한 까다로운 방법이 기술된다. 그것은 관심있는 유전자의 3′끝에서 폴리히스티딘 코딩 서열을 첨가하는 것을 포함하며, 이는 고정 된 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 유전자 생성물의 간단한 정제를 허용합니다. 이 방법의 유전자 변형에는 PCR 이외의 효소 반응이 필요하지 않습니다. 유전자 중단 후 외인성 첨가에 의한 유전자 생성물의 복원은 유전자 기능을 결정하는 효율적인 방법이며, 이는 또한 다른 종에 적용될 수 있다.
Introduction
유전자의 기능의 분석은 일반적으로 관심있는 유전자가 중단된 균주에 야생 형 긴장의 표현형 특성의 비교를 관련시킵니다. 유전자 중단 균주가 생성되면, 유전자 제품의 외인성 추가는 기능적 복원을 허용한다.
후속 복원 검사에 필요한 정제된 유전자 제품을 얻는 가장 일반적인 방법은 대장균1에서이종 발현을 수행하는 것이다. 그러나, 막 단백질 또는 고분자 질량 단백질의 발현은 종종 이 시스템을 사용하여 어렵다1. 이러한 경우에, 표적 단백질은 일반적으로 유전자 생성물의 손실로 이끌어 낼 수 있는 단계의 복잡한 시리즈를 통해 단백질을 기본적으로 종합하는 세포에서 단리됩니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 유전자 파괴 방법2,PCR 기반 DNA 접합 방법3(지정 2단계 융합 PCR) 및 유전적 용 전기 천공에 따른 유전자 생성물 정제를 위한 간단한 절차가 개발되었습니다. 연쇄상 구균 뮤탄의변환 . 유전자 생성물의 C-말단에 폴리히스티딘 태그(His-tag)를 첨가하면 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 그 정제가 용이합니다.
그의 태그 발현 긴장을 격리하기 위하여는, 관심 있는 유전자의 전체 게놈 DNA (이 그의 꼬리표 발현 유전자 중단한 긴장에서)는 항생 저항하는 마커 유전자로 대체됩니다. 앞서 설명한 바와 같이 유전자 중단 균주를 생성하는 것과 거의 동일한 그의 태그 발현 균주를 생성하는 절차4,5. 따라서, 유전자 파괴 및 유전자 생성물 분리를 위한 방법은 기능분석을 위한 직렬 실험으로서 수행되어야 한다.
본 작에서, 폴리히스티딘 코딩 서열은 gtfC(GenBank 궤적 태그 SMU_1005) 유전자의 3′ 말단에 부착되고, 글루코실트랜스퍼라제-SI(GTF-SI)를 S. 뮤탄스6에인코딩한다. 이어서, 연쇄상 구균 종에서 발현 연구가 수행되었다. 대장균에 의한 이종 gtfC 발현을 달성하는 것은 어렵고, 이는 GTF-SI의 높은 분자량 때문에 가능성이 높다. 이 균주는 S. mutans 그의– gtfC라는 이름입니다. 야생형 S. 뮤탄스(S. 뮤탄스 WT)의 gtfC 및 스펙티노마이신 내성 유전자 카세트(spcr)7로 의 조직을 묘사한 개략적 그림과 그 유도체가 그림 1. GTF-SI는 카리오제닉 치과 용 생물막6의개발에 기여하는 분비 단백질입니다. 자당의 존재 하에, 부착 생물막은 WT S. 뮤탄스 균주에서 매끄러운 유리 표면에서 관찰되지만 S. 뮤탄스 gtfC-중단 균주(S. mutans ΔgtfC)2,5 . 생물막 형성은 재조합GTF-SI의 외인성 첨가 시 S. 뮤탄스 Δ gtfC에서 회복된다. 변형, S. 뮤탄스 그의-gtfC,다음 재조합 GTF-SI를 생산하는 데사용됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프라이머의 설계는 프로토콜에서 가장 중요한 단계입니다. gtfC-reverse 및 spcr-forward프라이머의 시퀀스는 gtfC의 3′ 끝 영역과 spcr의5′ 끝 영역의 시퀀스에 따라 자동으로 결정되었습니다. 각 프라이머에는 GS 링커와 5′ 영역에서 His-tag 코딩 시퀀스를 인코딩하는 24개의 보완 베이스가 포함되어 있습니다. 상류 측면 영역에 위치한 네이티브 조절 시퀀스의 중…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 일본과학진흥회(JSPS)(교부금 번호 16K15860 및 19K10471~T.M., 17K12032~M.I., 18K0926~N.H.) 및 SECOM 과학기술재단(SECOM)(보조금 번호 2010.10.19.19.1.1.19)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
Riferimenti
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