Oprensning af et Højmolekylært masse protein i Streptococcus mutans
Summary
Beskrevet her er en simpel metode til rensning af et genprodukt i Streptococcus mutans. Denne teknik kan være fordelagtig i oprensning af proteiner, især membran proteiner og højmolekylært masse proteiner, og kan anvendes med forskellige andre bakteriearter.
Abstract
Elucidation af et gens funktion indebærer typisk sammenligning af fænotypiske træk af vildtypestammer og stammer, hvor det gen af interesse er blevet forstyrret. Tab af funktion efter genafbrydelse genoprettes efterfølgende ved eksogen tilsætning af produktet af det afbrudte gen. Dette hjælper med at bestemme funktionen af genet. En tidligere beskrevet metode indebærer at generere en Gtfc -gene-forstyrret Streptococcus mutans stamme. Her beskrives en fordringsløs metode til rensning af Gtfc -genproduktet fra den nyligt genererede S. mutans stamme efter genafbrydelsen. Det indebærer tilsætning af en polyhistidin-kodning sekvens på 3 ′ ende af genet af interesse, som giver mulighed for enkel rensning af genproduktet ved hjælp af immobiliseret metalaffinitets kromatografi. Der kræves ingen andre enzymatiske reaktioner end PCR for den genetiske modifikation i denne metode. Gendannelsen af genproduktet ved udefrakommende tilsætning efter genafbrydelse er en effektiv metode til bestemmelse af genfunktion, som også kan tilpasses forskellige arter.
Introduction
Analyse af et gene’s funktion indebærer normalt sammenligning af fænotypiske træk af vild-type stammer til stammer, hvor genet af interesse er blevet forstyrret. Når den genforstyrrede stamme produceres, giver eksogen tilsætning af genproduktet mulighed for funktionel restaurering.
Den mest almindelige metode til opnåelse af rensede genprodukter, der kræves til efterfølgende restaurerings undersøgelser, er ved at udføre heterologt udtryk i Escherichia coli1. Men, ekspression af membran proteiner eller høj molekylmasse proteiner er ofte svært ved hjælp af dette system1. I disse tilfælde er målproteinet normalt isoleret fra cellerne, der oprindeligt syntetiserer proteinet gennem en kompleks række trin, hvilket kan føre til tab af genproduktet. For at overvinde disse problemer er der blevet udviklet en enkel procedure for genprodukt rensning efter en genafbrydningsmetode2, PCR-baseret DNA-splejsning-metode3 (udpeget to-trins fusions PCR) og elektro portering for genetiske omdannelse i Streptococcus mutans. Tilsætning af et polyhistidintag (hans-tag) til genproduktets C-endestation letter dets rensning ved immobiliseret metalaffinitets kromatografi (IMAC).
For at isolere hans-tag-udtrykke stamme, er hele genomisk DNA af genet af interesse (i denne hans-tag-udtrykker gene-forstyrret stamme) erstattet med et antibiotikum-resistent markør gen. Proceduren for generering af hans-tag-udtrykker Strainer næsten identisk med, at for at generere en gen-forstyrret stamme som beskrevet tidligere4,5. Metoderne til genafbrydelse og isolering af genproduktet bør derfor udføres som serie eksperimenter for den funktionelle analyse.
I det nuværende arbejde, en polyhistidin-kodning sekvens er knyttet til 3 ′ ende af Gtfc (genbank locus tag SMU_1005) gen, kodning glucosyltransferase-si (GTF-SI) i S. mutans6. Derefter blev der udført udtryks studier i en streptokokart. Opnåelse af heterologe Gtfc udtryk ved E. coli er vanskeligt, sandsynligvis på grund af den høje MOLEKYLÆRE masse af GTF-si. Denne stamme hedder S. mutans His-gtfc. En skematisk illustration, der skildrer organiseringen af gtfc -og Spectinomycin-resistens genkassetten (SPCr)7 loci i vildtype S. mutans (s. mutans WT) og derivater heraf er vist i Figur 1. GTF-si er et sekretorisk protein, der bidrager til udviklingen af kariogene Dental biofilm6. Under tilstedeværelse af saccharose observeres en over vedet biofilm på en glat glasoverflade i WT s. mutans stamme, men ikke i s. mutans gtfc-forstyrret stamme (S. mutans Δgtfc)2,5 . Dannelsen af biofilm er genoprettet i S. mutans Δgtfc ved udefrakommende tilsætning af det rekombinante GTF-si. Stammen, S. mutans hans-gtfc, bruges derefter til at producere den rekombinante GTF-si.
Protocol
Representative Results
Discussion
Design af primere er det mest kritiske skridt i protokollen. Sekvenserne af gtfc-reverse og SPCr-Forward primere blev automatisk fastlagt ud fra sekvenserne af både 3 ′ end-regionen gtfc og 5 ′ end-regionen i SPCr. Hver primer indeholder 24 komplementære baser, der indkoder en GS linker og en hans-tag-kodning sekvens i deres 5 ‘ regioner. Afbrydelse af de oprindelige lovgivningsmæssige sekvenser placeret i upstream ledsage regioner kan undgås ved tilsætni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for fremme af videnskab (JSPS) (Grant numre 16K15860 og 19K10471 til T. M., 17K12032 til M. I. og 18K09926 til N. H.) og SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (tilskudsnummer 2018.09.10 nr. 1).
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
Riferimenti
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
- Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
