Rensing av en High Molecular Mass protein i Streptococcus mutans
Summary
Beskrevet her er en enkel metode for rensing av et gen produkt i Streptococcus mutans. Denne teknikken kan være fordelaktig i rensing av proteiner, spesielt membran proteiner og høy molekyl masse proteiner, og kan brukes med ulike andre bakterielle arter.
Abstract
Elucidation av et gen funksjon innebærer vanligvis sammenligning av fenotypiske trekk av vill-type stammer og belastninger der genet av interesse har blitt forstyrret. Tap av funksjon etter genet avbrudd er senere restaurert av eksogene tillegg av produktet av forstyrret genet. Dette bidrar til å bestemme funksjonen av genet. En metode tidligere beskrevet innebærer å generere en gtfC Gene-forstyrret Streptococcus mutans belastning. Her er en lite krevende metode som er beskrevet for rensing av gtfC Gene produktet fra den nylig genererte S. mutans stamme etter gen forstyrrelsen. Det innebærer tillegg av en polyhistidinhale-koding sekvens på 3 ‘ slutten av genet av interesse, som tillater enkel rensing av genet produktet ved hjelp immobilisert metall affinitet kromatografi. Ingen enzymatisk reaksjoner enn PCR er nødvendig for genetisk modifisering i denne metoden. Restaurering av genet produktet ved eksogene tillegg etter gen avbrudd er en effektiv metode for å bestemme gen funksjon, som også kan tilpasses ulike arter.
Introduction
Analyse av et gen funksjon innebærer vanligvis sammenligning av fenotypiske trekk av vill-type stammer til belastninger der genet av interesse har blitt forstyrret. Når gen-forstyrret belastning er produsert, eksogene tillegg av genet produktet tillater funksjonell restaurering.
Den vanligste metoden for å skaffe renset gen produkter som kreves for påfølgende restaurering analysene er ved å utføre heterologous uttrykk i Escherichia coli1. Imidlertid er uttrykket av membran proteiner eller høy molekyl masse proteiner ofte vanskelig å bruke dette systemet1. I disse tilfellene er mål proteinet vanligvis isolert fra cellene som opprinnelig syntetiserer proteinet gjennom en komplisert serie med trinn, noe som kan føre til tap av gen produktet. For å løse disse problemene, en enkel prosedyre er utviklet for gen produkt rensing etter et gen avbrudd metode2, PCR-basert DNA skjøting metode3 (utpekt to-trinns fusjon PCR), og electroporation for genetisk transformasjon i Streptococcus mutans. Tilsetting av en polyhistidinhale tag (hans-tag) til C-Terminus av genet produktet Letter sin rensing av immobilisert metall affinitet kromatografi (IMAC).
For å isolere hans-tag-uttrykke belastning, hele genomisk DNA av genet av interesse (i denne His-tag-uttrykke genet-forstyrret belastning) er erstattet med en antibiotika-resistente markør genet. Prosedyren for å generere hans-tag-uttrykker strainis nesten identisk med det for å generere et gen-forstyrret belastning som beskrevet tidligere4,5. Derfor bør metodene for gen avbrudd og gen produkt isolasjon utføres som serielle eksperimenter for den funksjonelle analysen.
I dagens arbeid, en polyhistidinhale-koding sekvensen er festet til 3 ‘ slutten av gtfC (GenBank GEOMETRISKE tag SMU_1005) genet, koding GLUCOSYLTRANSFERASE-si (GTF-si) i S. mutans6. Deretter ble det utført uttrykks studier i en streptokokk art. Oppnå heterologous gtfC uttrykk ved E. coli er vanskelig, sannsynligvis på grunn av den høye molekylære MASSEN av GTF-si. Denne belastningen heter S. mutans hans-gtfC. En skjematisk illustrasjon som skildrer organiseringen av gtfC og spectinomycin motstands gen kassett (SPCr)7 Loci i vill-type S. mutans (s. mutans WT) og dets derivater er vist i Figur 1. GTF-SI er et sekretoriske protein som bidrar til utviklingen av cariogenic Dental biofilm6. Under tilstedeværelsen av sukrose, en tilhenger biofilm er observert på en glatt glass overflate i WT S. mutans belastning, men ikke i S. mutans gtfC-forstyrret belastning (S. mutans ΔgtfC)2,5 . Biofilm formasjon er gjenopprettet i S. mutans ΔgtfC upon EKSOGENE tillegg av rekombinant GTF-si. Belastningen, S. mutans hans-gtfC, brukes deretter til å produsere rekombinant GTF-si.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utformingen av grunning er det mest kritiske trinnet i protokollen. Sekvensene av gtfC-revers og SPCr-Forward primere ble automatisk bestemt basert på sekvenser av både 3 ‘ end regionen gtfC og 5 ‘ end regionen i SPCr. Hver primer inneholder 24 komplementære baser som koder en GS linker og en hans-tag-koding sekvens på sine 5 ‘ regioner. Forstyrrelse av de innfødte regulatoriske sekvenser ligger i oppstrøms flankerer regionene kan unngås ved tilsetning av h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Japan Society for Promotion of Science (JSP) (Grant tall 16K15860 og 19K10471 til T. M., 17K12032 til M. I., og 18K09926 til N. H.) og SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (Grant nummer 2018.09.10 nr. 1).
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
Riferimenti
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
- Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
