Purificación de una proteína de masa molecular alta en Streptococcus mutans
Summary
Aquí se describe un método simple para la purificación de un producto genético en Streptococcus mutans. Esta técnica puede ser ventajosa en la purificación de proteínas, especialmente proteínas de membrana y proteínas de alta masa molecular, y se puede utilizar con varias otras especies bacterianas.
Abstract
El esclarecimiento de la función de un gen típicamente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas y cepas de tipo salvaje en las que el gen de interés se ha interrumpido. La pérdida de la función después de la interrupción del gen se restaura posteriormente mediante la adición exógena del producto del gen alterado. Esto ayuda a determinar la función del gen. Un método descrito anteriormente implica la generación de una cepa de Streptococcus mutans interrumpida por el gen gtfC. Aquí, se describe un método poco exigente para purificar el producto del gen gtfC de la cepa s. mutans recién generada después de la interrupción del gen. Implica la adición de una secuencia de codificación de polihistidina en el extremo de 3o del gen de interés, que permite una simple purificación del producto genético mediante cromatografía de afinidad de metalinmovilizado. No se requieren reacciones enzimáticas que no sean PCR para la modificación genética en este método. La restauración del producto genético por adición exógena después de la interrupción del gen es un método eficaz para determinar la función génica, que también puede adaptarse a diferentes especies.
Introduction
El análisis de la función de un gen generalmente implica la comparación de rasgos fenotípicos de cepas de tipo salvaje con cepas en las que el gen de interés se ha interrumpido. Una vez producida la cepa interrumpida por genes, la adición exógena del producto genético permite la restauración funcional.
El método más común para obtener productos genéticos purificados necesarios para ensayos de restauración posteriores es mediante la realización de expresiones hetólogas en Escherichia coli1. Sin embargo, la expresión de proteínas de membrana o proteínas de alta masa molecular es a menudo difícil utilizando este sistema1. En estos casos, la proteína diana generalmente se aísla de las células que sintetiza la proteína de forma nativa a través de una serie compleja de pasos, que pueden conducir a la pérdida del producto genético. Para superar estos problemas, se ha desarrollado un procedimiento sencillo para la purificación de productos genéticos siguiendo un método de interrupción genética2,el método de empalme de ADN basado en PCR3 (designado PCR de fusión en dos pasos) y la electroporación para la genética transformación en Streptococcus mutans. La adición de una etiqueta de polihistidina (su etiqueta) a la terminal C del producto genético facilita su purificación mediante cromatografía de afinidad de metal inmovilizado (IMAC).
Para aislar la cepa que expresa su etiqueta, todo el ADN genómico del gen de interés (en esta cepa interrumpida genéticamente his-tag-expressing) se reemplaza por un gen marcador resistente a los antibióticos. El procedimiento para generar la cepa His-tag-expressing es casi idéntico al de generar una cepa interrumpida genéticamente como se describió anteriormente4,5. Por lo tanto, los métodos para la interrupción genética y el aislamiento de productos genéticos deben realizarse como experimentos en serie para el análisis funcional.
En el presente trabajo, se adjunta una secuencia de codificación de polihistidina al extremo de 3o del gen gtfC (GenBank locus tag SMU_1005), codificando glucosiltransferasa-SI (GTF-SI) en S. mutans6. Luego, se realizaron estudios de expresión en una especie estreptocócica. Lograr la expresión heterotróloga de gtfC por E. coli es difícil, probablemente debido a la alta masa molecular de GTF-SI. Esta variedad se llama S. mutans His-gtfC. Una ilustración esquemática que representa la organización del casete genético de resistencia a gtfC y espectromicina (spcr)7 loci en sándalo S. mutans (S. mutans WT) y sus derivados se muestra en Figura 1. El GTF-SI es una proteína secretor que contribuye al desarrollo de biofilm dental cariogénico6. Bajo la presencia de sacarosa, se observa una biopelícula adherente en una superficie de vidrio liso en la cepa WT S. mutans pero no en la cepa interrumpida de S. mutans gtfC(S. mutans ágtfC)2,5 . La formación de biopelículas se restaura en S. mutans ágtfC tras la adición exógena del GTF-SI recombinante. La cepa, S. mutans His-gtfC, se utiliza para producir el GTF-SI recombinante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El diseño de imprimadores es el paso más crítico en el protocolo. Las secuencias de las imprimaciones gtfC-reverse y spcr-forward se determinaron automáticamente en función de las secuencias de la región final de 3o de gtfC y de la región final de 5o de spcr. Cada imprimación incluye 24 bases complementarias que codifican un vinculador GS y una secuencia de codificación His-tag en sus regiones de 5′. La interrupción de las secuencias reglamentarias nativ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (números de concesión 16K15860 y 19K10471 a T. M., 17K12032 a M. I., y 18K9926 a N. H.) y la Fundación de Ciencia y Tecnología SECOM (SECOM) (número de concesión 2018.09.10 No. 1).
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
Riferimenti
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
- Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
