Rening av ett högt molekylärt Mass protein i Streptococcus mutans
Summary
Beskrivs här är en enkel metod för rening av en genprodukt i Streptococcus mutans. Denna teknik kan vara fördelaktigt vid rening av proteiner, särskilt membranproteiner och högmolekylära massa proteiner, och kan användas med olika andra bakteriearter.
Abstract
Klargörande av en gens funktion innebär vanligtvis jämförelser av fenotypiska egenskaper hos vildtyp stammar och stammar där genen av intresse har störts. Funktionsbortfall efter gen rubbning återställs därefter genom exogent tillägg av produkten av den störde genen. Detta hjälper till att bestämma funktionen av genen. En metod som tidigare beskrivits innebär att generera en Gtfc gen-störd Streptococcus mutans stam. Här beskrivs en krävande metod för rening av Gtfc -genprodukten från den nygenererade S. mutans stammen efter gen störningen. Det innebär tillsats av en polyhistidin-kodning sekvens vid 3 ′ slutet av genen av intresse, vilket möjliggör enkel rening av genprodukten med immobiliserade metallaffinitetskromatografi. Inga enzymatiska reaktioner än PCR krävs för den genetiska modifieringen i denna metod. Återställandet av genprodukten genom exogent tillägg efter gen rubbning är en effektiv metod för bestämning av genfunktion, som också kan anpassas till olika arter.
Introduction
Analys av en genfunktion innebär vanligtvis jämförelser av fenotypiska drag av vildtyp stammar till stammar där genen av intresse har störts. När den gen-störd stam produceras, exogent tillägg av genprodukten möjliggör funktionell restaurering.
Den vanligaste metoden för att erhålla renade genprodukter som krävs för efterföljande restaurerings analyser är genom att utföra heterologt uttryck i Escherichia coli1. Men, uttrycket av membranproteiner eller högmolekylära massa proteiner är ofta svårt att använda detta system1. I dessa fall är målproteinet vanligtvis isolerat från de celler som inbyggt syntetiserar proteinet genom en komplex serie av steg, vilket kan leda till förlust av genprodukten. För att övervinna dessa frågor har ett enkelt förfarande tagits fram för rening av genprodukter efter en gen störnings metod2, PCR-baserad DNA-skarvning metod3 (betecknat två-stegs fusion PCR) och elektroporation för genetiska omvandling i Streptococcus mutans. Tillsats av en polyhistidin tagg (his-tag) till C-terminus av genprodukten underlättar dess rening genom immobiliserade metallaffinitetskromatografi (IMAC).
För att isolera hans-tag-uttrycker stam, är hela genomisk DNA av genen av intresse (i detta hans-tag-uttrycker gen-störd stam) ersätts med en antibiotikaresistent markörgen. Förfarandet för att generera sin-tag-uttrycker strainis nästan identisk med den för att generera en gen-störd stam som beskrivs tidigare4,5. Därför bör metoderna för gen störningar och genprodukt isolering utföras som serie experiment för funktionell analys.
I det nuvarande arbetet, en polyhistidin-kodning sekvens är knuten till 3 ′ slutet av Gtfc (genbank Locus tag SMU_1005) gen, kodning glukosyltransferas-si (GTF-SI) i S. mutans6. Därefter utfördes uttrycks studier i en streptokockart. Att uppnå heterologa gtfc uttryck genom E. coli är svårt, sannolikt på grund av den höga molekylära massan av GTF-si. Denna stam heter S. mutans his-gtfc. En Schematisk illustration som skildrar organisationen av gtfc och Spektinomycin Resistance Gene kassett (SPCr)7 loci i Wild-Type S. mutans (s. mutans WT) och dess derivat visas i Figur 1. GTF-SI är ett sekretoriskt protein som bidrar till utvecklingen av cariogenic Dental biofilm6. Under närvaron av sackaros, en anhängare biofilmobserveras på en slät glasyta i WT S. mutans stam men inte i s. mutans gtfc-störd stam (s. mutans Δgtfc)2,5 . Biofilmformation återställs i S. mutans Δgtfc vid exogent tillägg av rekombinant GTF-si. Stammen, S. mutans his-gtfc, används sedan för att producera den rekombinanta GTF-si.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utformningen av primers är det mest kritiska steget i protokollet. Sekvenser av gtfc-Reverse och SPCr-Forward primers bestämdes automatiskt baserat på sekvenser av både 3 regionen gtfc och 5 region SPCr. Varje primer innehåller 24 kompletterande baser som kodar en GS-länkare och en his-tag-kodning sekvens i deras 5 ‘ regioner. Störningar av de infödda reglerande sekvenser som finns i uppströms kompletterande regioner kan undvikas genom tillägg av hans-ta…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av det japanska sällskapet för främjande av vetenskap (JSPS) (Grant nummer 16K15860 och 19K10471 till T. M., 17K12032 till M. I. och 18K09926 till N. H.) och SECOM Science and Technology Foundation (SECOM) (bidrags nummer 2018.09.10 nr 1).
Materials
| Agarose | Nippon Genetics | NE-AG02 | For agarose gel electrophoresis |
| Anaeropack | Mitsubishi Gas Chemical | A-03 | Anaerobic culture system |
| Anti-His-Tag monoclonal antibody | MBL | D291-7 | HRP-conjugated |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Measurement of protein concentration |
| Brain heart infusion broth | Becton, Dickinson | 237500 | Bacterial culture medium |
| CBB R-250 | Wako | 031-17922 | For biofilm staining |
| Centrifugal ultrafiltration unit | Sartorius | VS2032 | Buffer replacement and protein concentration |
| Centrifuge | Kubota | 7780II | |
| Chromatographic column | Bio-Rad | 7321010 | For IMAC |
| Dialysis membrane clamp | Fisher brand | 21-153-100 | |
| Dialysis tubing | As One | 2-316-06 | |
| DNA polymerase | Takara | R045A | High-fidelity DNA polymerase |
| DNA sequencing | Eurofins Genomics | ||
| ECL substrate | Bio-Rad | 170-5060 | For western blotting |
| EDTA (0.5 M pH 8.0) | Wako | 311-90075 | Tris-EDTA buffer preparation |
| Electroporation cuvette | Bio-Rad | 1652086 | 0.2 cm gap |
| Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| EtBr solution | Nippon Gene | 315-90051 | For agarose gel electrophoresis |
| Gel band cutter | Nippon Genetics | FG-830 | |
| Gel extraction kit | Nippon Genetics | FG-91202 | DNA extraction from agarose gel |
| Imager | GE Healthcare | 29083461 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Imidazole | Wako | 095-00015 | Binding buffer and elution buffer preparation |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | EZ-022 | Temperature setting: 4 °C |
| Incubator | Nippon Medical & Chemical Instruments | LH-100-RDS | Temperature setting: 37 °C |
| Membrane filter | Merck Millipore | JGWP04700 | 0.2 µm diameter |
| Microcentrifuge | Kubota | 3740 | |
| NaCl | Wako | 191-01665 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaH2PO4·2H2O | Wako | 192-02815 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| NaOH | Wako | 198-13765 | Preparation of binding buffer and elution buffer |
| (NH4)2SO4 | Wako | 015-06737 | Ammonium sulfate precipitation |
| Ni-charged resin | Bio-Rad | 1560133 | For IMAC |
| PCR primers | Eurofins Genomics | Custom-ordered | |
| Protein standard | Bio-Rad | 161-0381 | For SDS-PAGE and western blotting |
| Solvent filtration apparatus | As One | FH-1G | |
| Spectinomycin | Wako | 195-11531 | Antibiotics; use at 100 μg/mL |
| Sterile syringe filter | Merckmillipore | SLGV004SL | 0.22 µm diameter |
| Streptococus mutans ΔgtfC | Stock strain in the lab. | gtfC replaced with spcr | |
| Streptococus mutans UA159 | Stock strain in the lab. | S. mutans ATCC 700610, Wild-type strain | |
| Sucrose | Wako | 196-00015 | For biofilm development |
| TAE (50 × ) | Nippon Gene | 313-90035 | For agarose gel electrophoresis |
| Thermal cycler | Bio-Rad | PTC-200 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | Wako | 314-90065 | Tris-EDTA buffer preparation |
Riferimenti
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Edition. , (2001).
- Murata, T., Ishikawa, M., Shibuya, K., Hanada, N. Method for functional analysis of a gene of interest in Streptococcus mutans: gene disruption followed by purification of a polyhistidine-tagged gene product. Journal of Microbiological Methods. 155, 49-54 (2018).
- Horton, R. M., Cai, Z., Ho, S. M., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).
- Murata, T., Hanada, N. Contribution of chloride channel permease to fluoride resistance in Streptococcus mutans. FEMS Microbiology Letters. 363 (11), 101 (2016).
- Murata, T., Okada, A., Matin, K., Hanada, N. Generation of a gene-disrupted Streptococcus mutans strain without gene cloning. Journal of Visualized Experiments. (128), (2017).
- Hanada, N., Kuramitsu, H. K. Isolation and characterization of the Streptococcus mutansgtfC gene, coding for synthesis of both soluble and insoluble glucans. Infection and Immunity. 56 (8), 1999-2005 (1988).
- LeBlanc, D. J., Lee, L. N., Inamine, J. M. Cloning and nucleotide base sequence analysis of a spectinomycin adenyltransferase AAD(9) determinant from Enterococcus faecalis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 35 (9), 1804-1810 (1991).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Database, J. S. E. PCR: The Polymerase Chain Reaction. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. DNA Gel Electrophoresis. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. Gel Purification. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Wingfield, P. T. Protein precipitation using ammonium sulfate. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
- Database, J. S. E. Separating Protein with SDS-PAGE. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Database, J. S. E. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Perry, D., Wondrack, L. M., Kuramitsu, H. K. Genetic transformation of putative cariogenic properties in Streptococcus mutans. Infection and Immunology. 41 (2), 722-727 (1983).
- Lau, P. C., Sung, C. K., Lee, J. H., Morrison, D. A., Cvitkovitch, D. G. PCR ligation mutagenesis in transformable streptococci: application and efficiency. Journal of Microbiological Methods. 49 (2), 193-205 (2002).
- Ge, X., Xu, P. Genome-wide gene deletions in Streptococcus sanguinis by high throughput PCR. Journal of Visualized Experiments. (69), (2012).
