इनविवो इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण (आईवीआईएल) विधि का उपयोग विवो ट्यूमर लक्ष्यीकरण और पूर्व विवो इम्यूनोस्टेनिंग में संयोजन का उपयोग करके जीवित जीवों में ऑन्कोलॉजिकल उद्देश्यों के लिए एंटीबॉडी और एंटीबॉडी संयुग्मी उद्देश्यों के विवो जैव वितरण में जांच करने के लिए किया जा सकता है। विधियों.
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) कैंसर का पता लगाने, निदान, और उपचार में महत्वपूर्ण उपकरण हैं। वे tumorigenesis में प्रोटीन की भूमिका को जानने के लिए उपयोग किया जाता है, ट्यूमर का पता लगाने और लक्षण को सक्षम करने के कैंसर biomarkers के लिए निर्देशित किया जा सकता है, और mAbs या एंटीबॉडी दवा conzugates के रूप में कैंसर चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं को सक्रिय करने के लिए, को बाधित करने के लिए संकेतन रास्ते, या सीधे विशिष्ट प्रतिजन ले जाने की कोशिकाओं को मारने. विकास और उपन्यास और अत्यधिक विशिष्ट mAbs के उत्पादन में नैदानिक प्रगति के बावजूद, नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों जटिलता और ट्यूमर microenvironment की विषमता से बिगड़ा जा सकता है. इस प्रकार, कुशल एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा और निदान के विकास के लिए, जीवित ट्यूमर microenvironment के साथ एंटीबॉडी आधारित संयुग्मी के जैव वितरण और बातचीत का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहाँ, हम Vivo इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण (IVIL) में विवो शारीरिक और रोग की स्थिति में एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय और निदान की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक नए दृष्टिकोण के रूप में वर्णन करते हैं। इस तकनीक में, एक चिकित्सीय या नैदानिक प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी को अलग ट्यूमर में माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ विवो और स्थानीयकृत पूर्व विवो में अंतःशिरा इंजेक्शन दिया जाता है। इसलिए, आईवीआईएल एंटीबॉडी आधारित दवाओं और लक्षित एजेंटों के विवो जैव वितरण को दर्शाता है। दो IVIL अनुप्रयोगों स्तन कैंसर के आणविक इमेजिंग के लिए एंटीबॉडी आधारित विपरीत एजेंटों के biodistribution और पहुँच का आकलन वर्णित हैं. इस प्रोटोकॉल भविष्य के उपयोगकर्ताओं को अपने एंटीबॉडी आधारित अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए IVIL विधि को अनुकूलित करने की अनुमति देगा.
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAb) बड़े ग्लाइकोप्रोटीन (लगभग 150 केडीए) इम्यूनोग्लोबुलिन सुपरफैमिली हैं जो बी कोशिकाओं द्वारा स्रावित होते हैं और प्रतिरक्षा प्रणाली में एक प्राथमिक समारोह की पहचान करने और या तो जैविक समारोह को बाधित करते हैं, या के लिए चिह्नित करते हैं विनाश, जीवाणु या वायरल रोगजनकों, और कैंसर की कोशिकाओं पर असामान्य प्रोटीन अभिव्यक्ति पहचान सकते हैं1. एंटीबॉडीज अपने विशिष्ट प्रतीक के प्रति बहुत अधिक आत्मीयता रख सकते हैं , जो उन्हें बायोमेडिसिन2में अत्यधिक आशाजनक साधन बनाते हैं . मिलस्टीन और केहलर द्वारा हाइब्रिडोमा प्रौद्योगिकी के विकास के साथ ( 1984 में नोबेल पुरस्कार से सम्मानित), mAbs का उत्पादन संभव हो गया3. बाद में, मानव mAbs phage प्रदर्शन प्रौद्योगिकी या ट्रांसजेनिक माउस उपभेदों का उपयोग कर उत्पन्न किया गया और उपन्यास अनुसंधान उपकरण और चिकित्साउपकरण 4,5के रूप में उनके उपयोग में क्रांति ला दी.
कैंसर एक विश्वव्यापी स्वास्थ्य मुद्दा है और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है जिससे रोकथाम, पता लगाने और चिकित्सा6के लिए उपन्यास दृष्टिकोण की आवश्यकता पैदा होती है। तारीख करने के लिए, mAbs ट्यूमरजनन में जीन और उनके प्रोटीन की भूमिका के extrication की अनुमति दी है और जब कैंसर biomarkers के खिलाफ निर्देशित, ट्यूमर का पता लगाने और रोगी स्तरीकरण के लिए लक्षण सक्षम कर सकते हैं. कैंसर चिकित्सा के लिए, द्विविशिष्ट mAbs, एंटीबॉडी दवा conzugates, और छोटे एंटीबॉडी टुकड़े चिकित्सकीय के रूप में विकसित किया जा रहा है, और लक्षित दवा वितरण के लिए चिकित्सीय प्रभावकारिता बढ़ाने के लिए7. इसके अतिरिक्त, एंटीबॉडी इस तरह के फ्लोरोसेंट निर्देशित सर्जरी, photoacoustic (पीए) इमेजिंग, अल्ट्रासाउंड (अमेरिका) आणविक इमेजिंग, और चिकित्सकीय इस्तेमाल किया positron उत्सर्जन के रूप में आणविक इमेजिंग तरीकों के लिए विपरीत एजेंटों के biomarker लक्ष्यीकरण के लिए सेवा टोमोग्राफी (पीईटी) या एकल फोटॉन उत्सर्जन परिकलित टोमोग्राफी (स्पेक्ट)8| अंत में, एंटीबॉडी भी theranostic एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है रोगियों के स्तरीकरण और लक्षित चिकित्सा9के लिए प्रतिक्रिया निगरानी को सक्षम करने के लिए. इसलिए, उपन्यास mAbs कैंसर का पता लगाने, निदान, और उपचार में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए शुरू कर रहे हैं.
विकास और उपन्यास और अत्यधिक विशिष्ट mAbs के उत्पादन में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, नैदानिक और चिकित्सीय अनुप्रयोगों ट्यूमर पर्यावरण की जटिलता के कारण अप्रभावी प्रदान किया जा सकता है. एंटीबॉडी अन्योन्यक्रियाएं एपिटोप के प्रकार पर निर्भर करती हैं, अर्थात्,चाहे वह रेखीय हो या संपिंडन10. प्रतिजनों की मान्यता के अलावा, एंटीबॉडी को एंटीजन व्यक्त करने वाली लक्ष्य कोशिकाओं तक पहुंचने के लिए पोत की दीवारों, बेसल झिल्ली, और ट्यूमर स्ट्रोमा जैसे प्राकृतिक बाधाओं को दूर करने की आवश्यकता है। एंटीबॉडी ऊतक के साथ बातचीत न केवल चर टुकड़ा प्रतिजन बंधन (फैब) डोमेन के माध्यम से, लेकिन यह भी लगातार क्रिस्टलीय टुकड़ा (एफसी) के माध्यम से जो आगे ऑफ साइट बातचीत की ओर जाताहै 11. लक्ष्यीकरण भी ट्यूमर थोक भर में ट्यूमर मार्करों की विषम अभिव्यक्ति और ट्यूमर संवहनी और लसीका प्रणाली12,13में विषमता से जटिल है . इसके अलावा, ट्यूमर microenvironment कैंसर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट्स जो ट्यूमर कोशिकाओं का समर्थन से बना है, ट्यूमर प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबाने, और ट्यूमर endothelium जो ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के परिवहन का समर्थन करता है, के सभी जो एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा या निदान के प्रवेश, वितरण, और उपलब्धता के साथ हस्तक्षेप करते हैं। कुल मिलाकर, इन विचारों चिकित्सकीय या नैदानिक प्रभावकारिता सीमित कर सकते हैं, उपचार प्रतिक्रिया को कम करने, और ट्यूमर प्रतिरोध में परिणाम हो सकता है.
इसलिए, कुशल एंटीबॉडी आधारित चिकित्सा और निदान के विकास के लिए, ट्यूमर microenvironment के भीतर एंटीबॉडी आधारित संयुग्मी के जैव वितरण और बातचीत का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान में, पूर्व नैदानिक अध्ययन में, ट्यूमर अनुसंधान मॉडल में मार्कर अभिव्यक्ति इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) ट्यूमर वर्गों14के धुंधला द्वारा पूर्व vivo विश्लेषण किया है। मानक IF धुंधला प्राथमिक मार्कर-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ किया जाता है जो तब माध्यमिक फ्लोरोसेंटद्वारा पूर्व विवो ट्यूमर ऊतक स्लाइस कि जानवर से अलग किया गया है पर एंटीबॉडी लेबल द्वारा प्रकाश डाला जाता है. इस तकनीक ऊतक निर्धारण के समय मार्कर के स्थिर स्थान पर प्रकाश डाला गया है और कैसे एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय या निदान वितरित या शारीरिक स्थितियों में बातचीत हो सकती है में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करता है. पीईटी, स्पेक्टर, अमेरिका और पीए द्वारा आण्विक इमेजिंग पूर्व नैदानिक मॉडल 8,15में एंटीबॉडी-कंजुटेड कंट्रास्ट एजेंट वितरण के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। के रूप में इन इमेजिंग रूपरेखा गैर इनवेसिव हैं, अनुदैर्घ्य अध्ययन किया जा सकता है और समय के प्रति समूह जानवरों की एक न्यूनतम संख्या के साथ डेटा एकत्र किया जा सकता है. हालांकि, इन गैर इनवेसिव आणविक इमेजिंग दृष्टिकोण काफी संवेदनशील नहीं हैं और सेलुलर स्तर पर एंटीबॉडी वितरण के स्थानीयकरण के लिए पर्याप्त संकल्प नहीं है. इसके अतिरिक्त, प्राथमिक एंटीबॉडी की भौतिक और जैविक विशेषताओं को एक विपरीत एजेंट16के संयोजन से काफी बदल सकता है।
आदेश में vivo शारीरिक और रोग की स्थिति को ध्यान में रखने के लिए कैसे एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय और निदान ट्यूमर वातावरण के भीतर बातचीत और उच्च संकल्प सेलुलर और यहां तक कि उप-कोशिक वितरण प्राप्त करने के लिए गैर-संयोजित एंटीबॉडी की प्रोफाइल, हम एक IF दृष्टिकोण का प्रस्ताव करते हैं, जिसे विवो इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्थानीयकरण (आईवीआईएल) में समझा जाता है, जिसमें एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी को विवो में अंतःशिरा इंजेक्शन दिया जाता है। एंटीबॉडी आधारित चिकित्सकीय या नैदानिक, एक प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में कार्य, कार्यात्मक रक्त वाहिकाओं में प्रसारित और अत्यधिक सटीक, रहने वाले ट्यूमर वातावरण में अपने लक्ष्य प्रोटीन को बांधता है। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ विवो लेबल ट्यूमर के अलगाव के बाद, एक माध्यमिक एंटीबॉडी संचित स्थानीयकरण और बनाए रखा एंटीबॉडी संयुग्मी करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह दृष्टिकोण पहले से वर्णित यदि ऊतक विज्ञान दृष्टिकोण के समान है जो फ्लोरोसेंट रूप से लेबल किए गए एंटीबॉडी17का इंजेक्शन लगाता है . हालांकि यहां, गैर-कंजुटेड एंटीबॉडी का उपयोग एंटीबॉडी संशोधन द्वारा प्रेरित जैव वितरण विशेषताओं में संभावित परिवर्तन से बचा जाता है। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी के पूर्व vivo आवेदन ऊतक संग्रह और प्रसंस्करण के दौरान फ्लोरोसेंट संकेत के एक संभावित नुकसान से बचा जाता है और फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता के प्रवर्धन प्रदान करता है। हमारे लेबलिंग दृष्टिकोण एंटीबॉडी आधारित दवाओं और लक्षित एजेंटों के vivo biodistribution में दर्शाता है और उपन्यास नैदानिक और चिकित्सीय एजेंटों के विकास के लिए महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.
यहाँ, हम IVIL विधि के दो अनुप्रयोगों का वर्णन के रूप में पिछले अध्ययन में लागू किया गया है स्तन कैंसर का पता लगाने के लिए आणविक इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए एंटीबॉडी आधारित विपरीत एजेंटों की biodistribution और पहुँच की जांच. सबसे पहले, एक एंटीबॉडी के biodistribution के पास अवरक्त डाई संयुग्मी (एंटी-B7-H3 एंटीबॉडी के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई, indocyanine हरे, B7-H3-ICG) और isotype नियंत्रण एजेंट (Iso-ICG) फ्लोरोसेंट और photoacoustic आणविक के लिए बाध्य इमेजिंग18का पता लगाया है. इस अनुप्रयोग की विधि प्रोटोकॉल में वर्णित है। इसके बाद, netrin-1 करने के लिए एक conformationally संवेदनशील एंटीबॉडी के biodistribution परिणाम, आम तौर पर पारंपरिक IF इमेजिंग के साथ पता लगाने योग्य नहीं, अल्ट्रासाउंड आणविक इमेजिंग के साथ प्रयोग किया जाता है, मात्रा निर्धारित है और प्रतिनिधि परिणाम में प्रस्तुत19. इस प्रोटोकॉल कागज के समापन पर, पाठकों को अपने एंटीबॉडी आधारित अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए IVIL विधि अपनाने सहज महसूस करना चाहिए.
इस विधि में कई महत्वपूर्ण चरण हैं और सफल कार्यान्वयन सुनिश्चित करने के लिए संभावित संशोधनों की आवश्यकता है। सबसे पहले, एंटीबॉडी की खुराक और समय / एंटीबॉडी संयुग्मी अंतःशिरा इंजेक्शन विशिष्ट आवेदन कर?…
The authors have nothing to disclose.
हम चर्चा और उपकरणों के उपयोग के लिए डॉ एंड्रयू ओल्सन (स्टैनफोर्ड न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सेवा) धन्यवाद। हम डॉ Juergen के विलमैन उनकी सलाह के लिए धन्यवाद. इस अध्ययन NIH R21EB022214 अनुदान (KEW), NIH R25CA118681 प्रशिक्षण अनुदान (KEW), और NIH K99EB023279 (KEW) द्वारा समर्थित किया गया था. स्टैनफोर्ड न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सेवा NIH NS069375 द्वारा समर्थित किया गया था.
Animal Model | |||
FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
Animal Handling Supplies | |||
27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Tissue Collection | |||
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Antibodies | |||
AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
Reagents | |||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
Indocyanine Green – NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Supplies | |||
Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
Software | |||
FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |