हम पतली फिल्म एक थाली पाठक का उपयोग कर स्थितियों के तहत airway सतह तरल पीएच के गतिशील माप बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
हाल के वर्षों में, वायुमार्ग में श्लैष्मिक सतह पीएच के महत्व एयरवे सतह तरल (asl) जलयोजन, बलगम चिपचिपाहट और रोगाणुरोधी पेप्टाइड की गतिविधि को विनियमित करने की क्षमता द्वारा प्रकाश डाला गया है की जंमजात रक्षा में शामिल प्रमुख मापदंडों फेफड़ों. यह सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF) के रूप में पुरानी श्वसन रोगों के क्षेत्र में प्राथमिक प्रासंगिकता है, जहां इन मापदंडों को डिस्रेगुलेटेड कर रहे हैं । जबकि विभिंन समूहों का अध्ययन किया है ASL pH दोनों में vivo और इन विट्रो, उनके तरीकों की रिपोर्ट ASL पीएच मूल्यों की एक अपेक्षाकृत विस्तृत श्रृंखला और भी विरोधाभासी किसी भी गैर के बीच पीएच मतभेद के बारे में निष्कर्ष CF और CF कोशिकाओं । इसके अलावा, उनके प्रोटोकॉल हमेशा पर्याप्त जानकारी प्रदान नहीं करने के लिए reproducibility सुनिश्चित करने के लिए, सबसे कम throughput रहे है और महंगे उपकरण या विशेष ज्ञान को लागू करने की आवश्यकता है, उंहें सबसे प्रयोगशालाओं में स्थापित करने के लिए मुश्किल बना । यहां हम एक अर्द्ध स्वचालित फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक परख कि पतली फिल्म की स्थिति के तहत ASL पीएच के वास्तविक समय मापन में सक्षम बनाता है कि और अधिक बारीकी से vivo स्थिति में सदृश वर्णन । इस तकनीक की अनुमति देता है एकाधिक airway संस्कृतियों से कई घंटे के लिए स्थिर माप के लिए एक साथ और, महत्वपूर्ण बात, एगोनिस्ट और inhibitors के जवाब में asl पीएच में गतिशील परिवर्तन पर नजर रखी जा सकती है । इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं (haecs) के asl एक पीएच संवेदनशील डाई के साथ रात भर दाग रहे है ताकि पतली फिल्म की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त तरल पदार्थ के पुनरवशोषण के लिए अनुमति देने के लिए । प्रतिदीप्ति उपस्थिति या agonists की अनुपस्थिति में नजर रखी है के बाद, पीएच अंशांकन मात्रा और डाई एकाग्रता के लिए सही करने के लिए स्वस्थानी में किया जाता है. विधि वर्णित करने के लिए आवश्यक नियंत्रण प्रदान करता है स्थिर और reproducible ASL पीएच माप है, जो अंततः निजीकृत दवा के लिए एक दवा खोज मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही अंय उपकला ऊतकों और प्रयोगात्मक के लिए अनुकूलित भड़काऊ और/या मेजबान-रोगज़नक़ मॉडल के रूप में शर्तों, ।
वायुमार्ग उपकला एक पतली (~ 10 μm) तरल पदार्थ परत द्वारा कवर किया जाता है एयरवे सतह तरल (ASL) करार दिया । इस asl की संरचना और गहराई (जलयोजन) कसकर विनियमित है और mucocilliescalator1,2,3,4द्वारा एयरवे क्लीयरेंस की दक्षता नियंत्रित करता है । हाल के वर्षों में, एएसएसएल एच+/एचसीओ3– सामग्री के महत्व को asl हाइड्रेशन5, एयरवे सूजन6 और संक्रमण7को विनियमित करने की क्षमता के कारण विभिन्न समूहों द्वारा प्रदर्शित किया गया है, 8 साथ ही बलगम चिपचिपापन8,9। महत्वपूर्ण बात है, हालांकि वहां कुछ विवादों, कई अध्ययनों से इस तरह अस्थमा10,11,12, copd11के रूप में पुरानी airway रोगों में एयरवे पीएच के dysregulation की सूचना दी है, ब्रोंकाइटिस11, जीर्ण rhinosinusitis13,14 और सिस्टिक फाइब्रोसिस (CF)5,9,15,16,17, जो पता चलता है कि चिकित्सा कि ASL पीएच बहाल करने के लिए पुरानी airway रोगों के कई प्रकार के इलाज के लिए उपयोगी हो सकता है । सीएफ़, काकेशियन आबादी में सबसे आम ऑटोसोमल अप्रभावी आनुवंशिक रोग है और यह CF ट्रांजेम्बल चालकत्व नियामक (CFTR) जीन में उत्परिवर्तनों के कारण होता है. इस जीन एक आयनों कोड (hco3– और सीएल–) चैनल है कि आयन और द्रव परिवहन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और homeostasis उपकला18भर में । हालांकि cf एक बहु-अंग रोग है, फेफड़ों की विकृति रुग्णता और मृत्यु दर का मुख्य कारण है19,20 और cf में प्राथमिक दोष को ध्यान में रखते हुए सीएल का बिगड़ा परिवहन है– और hco3–, एक परिकल्पना कि cf के साथ लोगों में है कि extracellular द्रव पीएच जो लोग cf नहीं है की तुलना में dysविामिभित हो जाएगा कर सकते हैं । इस प्रकार, asl ph का मापन सीएफ़ अनुसंधान का एक सामयिक क्षेत्र रहा है और विभिंन समूहों ने cf में asl ph को मापने के लिए तकनीकों का विकास किया है एयरवेज.
Vivo में, एयरवे पीएच विभिन्न तकनीकों का उपयोग कर मापा गया है, माइक्रो-probes से (फाइबर ऑप्टिक, सोना या मोबिडियम जांच)5,21,22,23,24 के पीएच माप expectorated सामग्री या exhaled सांस घनेदार (ebc)10,11,12,25,26,27। सीएफ़ के अनुसंधान क्षेत्र में, पीएच का व्यापक अध्ययन इसके संभावित नैदानिक निहितार्थों के कारण किया जा रहा है । सैद्धांतिक रूप से, वायुमार्ग को और अधिक क्षारीय बनाने से जीवाणु की हत्या में वृद्धि हो सकती है और एक पूरे के रूप में एयरवे होमस्टोसिस में सुधार हो सकता है । तथापि, वीवो/एक्स वीवो अध्ययन में पीएच मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला की रिपोर्ट, और तारीख तक, परिणाम गैर-CF और cf एयरवेज के बीच पीएच में अंतर के अस्तित्व के बारे में निर्णायक नहीं हैं । प्रारंभिक 2000s में, विभिन्न समूहों EBC के पीएच की सूचना दी. गैर-रोगग्रस्त समूहों में, ph मान ४.६ से ८.५ के बीच थे, लेकिन दिलचस्प बात यह है कि, ebc पीएच को12,27CF के साथ लोगों में तीव्रता के दौरान अधिक अम्लीय पाया गया । अधिक हाल ही में, asl के vivo में माप में मानव और जानवरों के मॉडल CF की रिपोर्ट परस्पर विरोधी परिणाम16,17,21,22,23, 24 और यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि सीएफ़ एयरवेज गैर-cf वायुमार्ग की तुलना में अधिक अम्लीय है ।
के रूप में कम ASL पीएच के vivo माप में मुश्किल साबित कर दिया है तरल पदार्थ की बहुत छोटी राशि के कारण एयरवेज और रोग में बलगम प्लग की संभावित उपस्थिति, कई समूहों में बदल गया है ASL पीएच को मापने के लिए इन विट्रो प्रयोगों में, मुख्य रूप से तीन अलग तरीके. पहले दृष्टिकोण का उपयोग करता है dextran युग्मित सेल-impermeant पीएच संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंजक जो एक सूखी पाउडर के रूप में जोड़ रहे हैं, या तो सीधे asl करने के लिए या एक अक्रिय द्रव का उपयोग कर perfluorocarbon (पीएफसी)5,8,16 , 17 , 28 , 29 , 30 , 31 , ३२. हालांकि, इस तकनीक डाई कि संस्कृतियों में जोड़ा जाता है और डाई समुच्चय और नमूनों और/या प्रयोगों के बीच एकाग्रता में बड़ा अंतर और यहां तक कि एक ही नमूने के भीतर का एक जोखिम प्रस्तुत है की सटीक मात्रा पर थोड़ा नियंत्रण प्रदान करता है . यह भी आम तौर पर एक संनाभि माइक्रोस्कोप है, जो इसकी प्रयोज्यता और कई मामलों में सीमा के साथ प्रदर्शन किया गया है, कई नमूनों और रिकॉर्डिंग की स्थिति में परिवर्तन की विस्तृत निगरानी रोकता है । Asl पीएच को मापने के लिए नियोजित दूसरी विधि पीएच-सेंसिटिव माइक्रोइलेक्ट्रोड5,15का उपयोग है । ASL पीएच माप इसलिए फ्लोरोसेंट डाई एकाग्रता पर निर्भर नहीं कर रहे है और अधिक मजबूत और reproducible परिणाम देना चाहिए । हालांकि, इस विधि डायनेमिक, ASL pH के वास्तविक समय मापन के लिए अनुमति नहीं देता है, और न ही यह आसान विभिन्न शर्तों के तहत एकाधिक रीडिंग करने के लिए है । यह भी एक श्रम गहन, जटिल, प्रक्रिया है कि विशेषज्ञ उपकरणों की आवश्यकता है (microelectrode निर्माण/इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग उपकरणों) और बाद पीएच माप और अंशांकन के लिए नमूने के संग्रह के लिए प्रशिक्षण. इसके अलावा, इन दो तकनीकों को भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम का उत्पादन करने की क्षमता में कुछ विसंगतियों को दिखाया गया है: पीएच-संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई विधि का प्रयोग, तांग एट अल. ७.३५ के मूल्यों की सूचना के लिए गैर के लिए-CF ASL और ७.० के लिए CF ASL8 जबकि एक अधिक में एक ही समूह से हाल के पेपर, ASL पीएच ६.९ और गैर के लिए ६.४-CF और CF, क्रमशः17था । इसी प्रकार, माइक्रोइलेक्ट्रोड मापन ने २००३ से अध्ययन में गैर-सीएफ एएसएल में ६.४ और सीएफ एएसएल में ६.१ का मान दिया जबकि इसी समूह ने ६.४५5से एक अध्ययन में गैर-सीएफ एएसएल और २०१३ के लिए ६.७ के मूल्यों की सूचना दी । अंत में, तीसरे दृष्टिकोण में, शोधकर्ताओं ने कमजोर buffered समाधान की एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में जोड़ (mucosal) संस्कृतियों की सतह पर, इस प्रकार पतली फिल्म की स्थिति को नष्ट करने और ASL संरचना में फेरबदल, और संभवतः इसके नियमन. ph तो मापा जाता है या तो पीएच का उपयोग कर संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंग३३, एक पीएच द्वारा एक ussing चैंबर13,14, या पतला asl की आवश्यकता है संस्कृतियों और पीएच एक पीएच का उपयोग कर मापा से हटा दिया जाएगा में स्टेट टाइट्रेट करना पद्धति इलेक्ट्रोड, विश्लेषक या लिटमस३४स्ट्रिप्स । ASL पीएच की सही माप में एक और कठिनाई एक मानक वक्र है कि संभव के रूप में के रूप में सटीक है की स्थापना है । वास्तव में, रीडिंग एक इलेक्ट्रोड है कि एक राल के माध्यम से बिजली की क्षमता में अंतर को मापने या पीएच के प्रति संवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करेंगे के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं, इन दोनों तरीकों नमूने जा रहा है की स्थानीय microenvironment से प्रभावित हो जाएगा मापा. अधिक विशेष रूप से, डिसोसिएशन स्थिरांक (केडी) रंगों के तापमान, ईओण ताकत, चिपचिपापन के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन और संभावित बलगम के रूप में सेलुलर घटकों के साथ डाई के संभावित बातचीत के आधार पर काफी भिन्न हो सकते हैं.
आदेश में प्रयास करें और इन तकनीकी मुद्दों के कई पर काबू पाने के लिए, के रूप में अच्छी तरह के रूप में विकसित करने के लिए एक और अधिक गतिशील, सरल और उच्च throughput विधि, हम एक इन विट्रो तकनीक है कि रिकॉर्ड प्राथमिक hAEC संस्कृतियों में ASL पीएच एक सेल का उपयोग कर-impermeant पीएच संवेदनशील की स्थापना की है एक मानक वाणिज्यिक प्लेट में फ्लोरोसेंट डाई-पाठक । विधि, पतली फिल्म की स्थिति के तहत पूरी तरह से विभेदित 3 डी सेल संस्कृतियों के ASL पीएच की प्रतिलिपि, गतिशील, अर्द्ध स्वचालित, वास्तविक समय मापन उत्पंन करता है । एक बहु के उपयोग के माध्यम से अच्छी तरह से थाली पाठक, इस अर्द्ध स्वचालित परख 12 घंटे से अधिक 24 शर्तों के लिए पीएच के एक साथ माप के पास कर सकते है और विभिंन एगोनिस्ट या inhibitors जोड़ने के प्रभाव की निगरानी कर सकते हैं । इस पत्र में हम विस्तार में पद्धति का वर्णन और सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की स्थिति है कि तकनीक पुष्टि के तहत प्रतिनिधि परिणाम रिपोर्ट ।
यहां हम प्राथमिक मानव airway उपकला कोशिकाओं में ASL पीएच के गतिशील माप के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं के ऊपरी सतह से बलगम धोने शामिल, मापने और प्रयोग में के रूप में एक ही मापदंडों का उपयोग पृष्ठभूमि घटाकर, z-स्थिति और लाभ का अनुकूलन और एक सीटू पीएच अंशांकन में प्रदर्शन.
कोशिकाओं को धोने का पहला कदम बलगम की एक मोटी परत के रूप में महत्वपूर्ण है (मैं) pericilliarlayer (PCL) तक पहुँचने से रंगों को रोकने और (ii) देरी या agonists/अवरोधकों के जवाब में प्रतिदीप्ति में परिवर्तन का पता लगाने को रोकने । हमारी विधि का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था कि कैसे प्राथमिक हासेक hco3 की गतिविधि संग्राहक और एच+ ट्रांसपोर्टर agonists के जवाब में. हालांकि यह कैसे PCL पीएच में परिवर्तन बलगम पीएच में परिवर्तन करने के लिए संबंधित की जांच करने के लिए दिलचस्प हो जाएगा, इस प्रोटोकॉल के आगे विकास, अलग आणविक वजन के उपयोग सहित की जरूरत है-dextrans को विभेदीक रूप से लक्ष्य 2 परतों और जेड के माध्यम से स्कैन पूरे ASL.
पृष्ठभूमि मापन इस प्रोटोकॉल का एक और महत्वपूर्ण कदम है । पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक airway उपकला के शीर्षस्थ सतह शायद ही कभी पूरी तरह से फ्लैट है जो प्रकाश पथ और इसलिए पृष्ठभूमि को प्रभावित करेगा । यह सुनिश्चित करना कि पृष्ठभूमि रीडिंग कुओं की एक ही स्थानीय अंक में प्रदर्शन के दौरान के रूप में किया जाता है reproducibility और रिकॉर्डिंग की स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है ।
Z-स्थिति और लाभ का अनुकूलन आवश्यक कदम है कि फ्लोरिसेंट डाई कि इस्तेमाल किया जाएगा के प्रत्येक अलग एकाग्रता के लिए स्थापित करने की आवश्यकता है । इससे हाई इंटर-एक्सपेरीमेंट वैरिएबिलिटी पर रोक लगेगी । एक बार स्थापित, हमारे परख स्थिर और reproducible परिणाम प्रदान करता है । इस के लिए कारणों में से एक यह है कि रंग तरल पदार्थ है कि आसानी से उपकला द्वारा reabsorbed है की एक छोटी मात्रा में कोशिकाओं पर ऊपरी सतह पर जोड़ रहे हैं, एक समरूप ASL लेबल छोड़ । ASL दाग करने के लिए एक और तरीका है, कि समान रूप से सफल हो सकता है, सूखी पाउडर या पीएफसी में एक “निलंबन” का इस्तेमाल किया । हालांकि यह समय की बचत हो सकता है (के रूप में प्रयोग आम तौर पर 2 एच के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं), यह संभावना नहीं है कि शुष्क डाई पूरी तरह से ASL में घुलनशील और इस प्रकार हो सकता है फार्म clumps । इस प्रकार पीएच-संवेदी डाई के अलग सांद्रता उपकला कोशिकाओं की सतह पर पाया जाएगा ।
में सीटू पीएच अंशांकन एक महत्वपूर्ण कदम के लिए सटीक, reproducible परिणाम प्राप्त करने के लिए है । के रूप में दिखाया गया है और परिणाम अनुभाग में समझाया, asl संस्करणों में अंतर प्रतिदीप्ति गिनती को प्रभावित करेगा और इसलिए अंतर्वेशित पीएच मान (चित्रा 2 और चित्रा 3). Whilst विभिंन समूहों पहले asl पीएच माप प्रकाशित किया है, मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला भी विभिंन एक ही समूह8,17द्वारा प्रकाशित अध्ययनों के बीच प्राप्त किया गया है । हमें विश्वास है कि स्वस्थानी कैलिब्रेशन में प्रदर्शन करके, परिणाम अधिक reproducible हो जाएगा । अंय पीएच अंशांकन तकनीक है, जो उच्च K का उपयोग करें+/नाइजीरीसिन (या एकाधिक ionophores) विधि मानक वक्र28,29,30उत्पंन करने के लिए की तुलना में, परख यहां प्रस्तुत लाभ है कि , जब तक हर कदम एक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाता है, ASL पीएच के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं धोया, रखा जा सकता है और अंय प्रयोगों के लिए reused किया है कि उपचार प्रदर्शन अचल उपकला कोशिकाओं को प्रभावित नहीं करते ।
विकास और इस परख के अनुकूलन reproducible परिणाम प्रदान की है और हम इस विधि उनके ASL पीएच माप के साथ अंय समूहों में मदद मिलेगी विश्वास करते हैं । हालांकि, इस तकनीक में भी सेट अप और उपयोग किए जा रहे कक्षों के प्रकार के कारण कुछ सीमाएं हैं । निगरानी ASL पीएच कि यहां प्रस्तुत की तुलना में एक लंबे समय अवधि में (> 8-10 ज) मुश्किल साबित हो सकता है के रूप में एक लंबी अवधि के उच्च आर्द्रता पर्यावरण उपकरण और तथ्य यह है कि सबसे थाली पाठकों केवल एक से अधिक काइनेटिक रीडिंग रिकॉर्ड करने के लिए विकल्प की पेशकश को नुकसान हो सकता है समय की निश्चित मात्रा (आमतौर पर 24 ज) । पूरी तरह से विभेदित प्राथमिक haecs का उपयोग करने के तरीके में महत्वपूर्ण है कि भिंनता के विभिंन चरणों hco3– और एच+ ट्रांसपोर्टरों की अभिव्यक्ति को प्रभावित करेगा । तथापि, तनु फिल्म स्थितियों के अंतर्गत उगाई गई कोशिकाओं में एएसएल की मात्रा को ठीक से नियंत्रित करने की वस्तुत कोई संभावना नहीं है । के रूप में प्रोटोकॉल और परिणाम वर्गों में कहा गया है, मात्रा में परिवर्तन प्रतिदीप्ति अनुपात को प्रभावित करेगा और यह दुर्भाग्य से लगता है कि कोशिकाओं में एक एकल व्यक्ति से हो, अलग अर्द्ध पारभासी का समर्थन करता है पर एक ही दिन वरीयता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, ASL संस्करणों एक ही होगा । इस सीमा से उत्पंन, किसी भी एगोनिस्ट या अवरोध करनेवाला है कि तरल पदार्थ स्राव या अवशोषण को प्रभावित करेगा asl मात्रा और संभवतः प्रतिदीप्ति अनुपात को प्रभावित करेगा । हालांकि, हमारे परख में, अंशांकन वक्र प्रयोग के अंत में किया जाता है, तो हम मान सकते है कि मात्रा में इन परिवर्तनों को एक ही रास्ते में अंशांकन अनुपात को प्रभावित करेगा के रूप में काइनेटिक प्रयोग के दौरान । इस कारण से हम समूहों है कि इस परख के विकास में रुचि होगी सलाह के लिए, कम से 2-3 इस शर्त के रूप में परीक्षण के रूप में प्रत्येक शर्त के लिए एक मानक वक्र की स्थापना के लिए अनुमति देगा के अनुसार प्रतिकृति का उपयोग करें ।
यहां हम एक सरल, अर्द्ध स्वचालित, परख कि पतली फिल्म शर्तों के तहत श्लैष्मिक सतह पीएच के वास्तविक समय मापन की अनुमति देता है वर्तमान । यह एक पास में कई संस्कृतियों में गतिशील पीएच प्रतिक्रियाओं की जांच की क्षमता है कि अंतर और अंत दाता तुलना की अनुमति देता है । एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट polarized प्रणाली का उपयोग कर प्रारूप करने के लिए इस विधि upscaling (HTS ९६ अच्छी तरह से प्लेटें)३८ एक दवा की खोज परख के रूप में भी उच्च throughput प्रदान करेगा । इसके अलावा, हम कैसे इस तकनीक asl पीएच पर एगोनिस्ट की तीव्र प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और हम पहले से ही प्रकाशित किया है कि इस विधि CF haecs asl३९पर एक शीर्ष प्रोन पंप अवरोध करनेवाला के दीर्घकालिक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा कर सकते हैं दिखाया है । पीएच संक्रमण, सूजन, बलगम चिपचिपापन और आयन परिवहन को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है के रूप में, आणविक लक्ष्य है कि पीएच में वृद्धि कर सकते हैं जीर्ण फेफड़ों के रोगों के अनुसंधान क्षेत्रों में मूल्यवान हो जाएगा की पहचान करने और इस तकनीक को संभवतः सुविधा होगी व् यक्तिगत चिकित् सा पद्धतियों में दवा जांच का विकास । अंत में, के बाद से एसिड आधार homeostasis में dysregulation अंय रोगों में एक प्रमुख भूमिका निभाता है, इस प्रोटोकॉल अनुकूलित किया जा सकता है, अनुकूलन कदम के साथ, विभिंन उपकरणों के लिए (थाली पाठकों) और अंय उपकला कोशिकाओं के रूप में सेल प्रकार, । Extracellular अम्लता कैंसर की एक विशेषता है४०,४१,४२ और इस परख कैसे ठोस ट्यूमर कम पीएचई का उत्पादन या एक कम throughput दवा स्क्रीनिंग के लिए परख के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता का निर्धारण में मदद कर सकता है पीएच homeostasis की बहाली । इसी तरह, पुरानी airway रोगों के लिए के रूप में, यह भी एक व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण के विकास के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को दो सीएफ ट्रस्ट रणनीतिक अनुसंधान केंद्र अनुदान (SRC003 और SRC013) और एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद (MRC) अवधारणा अनुदान (MC_PC_15030) में विश्वास द्वारा समर्थित किया गया था । JG चिकित्सा अनुसंधान फाउंडेशन (MRF-091-0001-आरजी-GARNE) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एमबी एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद के नैदानिक वैज्ञानिक फैलोशिप (MR/M008797/1) द्वारा समर्थित किया गया था । IH एक Wellcome ट्रस्ट नैदानिक प्रशिक्षण फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था (203520/ इस शोध को न्यूकैसल हॉस्पिटल्स एनएचएस फाउंडेशन ट्रस्ट और न्यूकैसल यूनिवर्सिटी पर आधारित नैशनल इंस्टिट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च न्यूकैसल बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर ने सपोर्ट किया । व्यक्त किए गए विचार लेखक (ओं) के हैं और यह आवश्यक रूप से एनएचएस, एनआईएचआर या स्वास्थ्य विभाग के नहीं हैं । डॉ Randell से प्राथमिक कोशिकाओं सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन अनुदान (BOUCHE15R0) और NIH अनुदान (P30DK065988) द्वारा समर्थित थे ।
0.2 µm syringe filter | Starlab | E4780-1226 | |
6.5 mm Transwell with 0.4 µm Pore Polyester Membrane Insert | Corning | 3470 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | 21115 | |
CFTRInh172 | RnD Systems (Tocris) | 3430 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 20 µM |
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning | 3524 | |
dextran-coupled pH-insensitive fluorescent dye: AlexaFluor488-dextran | ThermoFisher | D22910 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
dextran-coupled pH-sensitive fluorescent dye: pHrodo-dextran | ThermoFisher | P10361 | Stock Concentration: 1 mg/mL; Final Concentration: 0.67 mg/mL |
D-glucose | Sigma Aldrich | G5767 | |
Forskolin | RnD Systems (Tocris) | 1099 | Stock Concentration: 50 mM; Final Concentration: 10 µM |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Cellstar | 655180 | |
Humidity cassette | TECAN | 30090495 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
MES | Sigma Aldrich | M3885 | |
MgCl2 | Sigma Aldrich | M1028 | |
NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaHepes | Sigma Aldrich | H3784 | |
Plate reader: TECAN SPARK 10M | TECAN | 30086375 | |
Tris | Sigma Aldrich | T1503 | |
Universal pH electrodes DJ 113 | VWR | 662-1385 |