Изоляция Ламина Проприа моноядерных клеток из Курина толстой с использованием коллагеназа E
Summary
Целью этого протокола является изоляция моноядерных клеток, которые находятся в ламинальной проприии толстой кишки путем ферментативного пищеварения тканей с помощью коллагеназы. Этот протокол позволяет эффективно изоляции моноядерных клеток в результате одной подвески клеток, которые, в свою очередь, могут быть использованы для надежного иммунофенотипирования.
Abstract
Кишечник является домом для наибольшего числа иммунных клеток в организме. Малые и большие кишечные иммунные системы полиции воздействия экзогенных антигенов и модулировать ответы на мощные микробиально производных иммунных стимулов. По этой причине, кишечник является основным целевым местом иммунной дисрегуляции и воспаления во многих заболеваниях, включая, но, не ограничивавшись воспалительными заболеваниями кишечника, такими как болезнь Крона и язвенный колит, трансплантат против хозяина болезни (GVHD) после кости трансплантации костного мозга (BMT), и многие аллергические и инфекционные заболевания. Морин модели желудочно-кишечного воспаления и колита в значительной степени используются для изучения осложнений Г.И. и предварительно оптимизировать стратегии профилактики и лечения. Данные, полученные из этих моделей с помощью изоляции и фенотипического анализа иммунных клеток из кишечника имеет решающее значение для дальнейшего иммунного понимания, которые могут быть применены для улучшения желудочно-кишечных и системных воспалительных расстройств. В этом отчете описывается высокоэффективный протокол для изоляции моноядерных клеток (MNC) от толстой кишки с помощью смешанного интерфейса градиента плотности на основе кремнезема. Этот метод воспроизволит значительное количество жизнеспособных лейкоцитов при минимизации загрязнения мусора, позволяя последующее иммунное фенотипирование путем цитометрии потока или другими методами.
Introduction
Хотя желудочно-кишечного тракта (ГИ) в первую очередь посвященобработке и реабсорбции питательных веществ из пищи, желудочно-кишечный тракт также поддерживает центральную роль в целостности сосудистой, лимфатической и нервной систем и многих других органов через его слизистой и субмукозной иммунной системы1. Иммунная система GI имеет влиятельную роль как в желудочно-кишечном и системном здоровье из-за его постоянного воздействия иностранных антигенов из пищи, сопутствующих бактерий, или вторжение патогенов1,2. Таким образом, иммунная система Г.И. должна поддерживать хрупкий баланс, в котором она переносит непатогенные антигены, адекватно реагируя на патогенные антигены1,2. Когда нарушается баланс толерантности и защиты, локализованы или системной иммунной дисрегуляции и воспаления может произойти в результате множества заболеваний1,2,3.
Кишечник таит в себе не менее 70% всех лимфоидных клеток в организме4. Большинство первичных иммунологических взаимодействий включают по крайней мере одну из трех иммунных станций в кишечнике: 1) Патчи Пейера, 2) Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) и 3) лимины проприа лимфоциты (LPL). Каждый из них состоит из сложной взаимосвязанной сети иммунных клеток, которые быстро реагируют на нормальные иммунные проблемы в кишечнике5. Ограниченный строма выше muscularis слизистые оболочки, слабо структурированные ламины propria является соединительной ткани слизистой оболочки кишечника и включает в себя леса для villus, сосуды, лимфатический дренаж, и слизистой нервной системы, а также многие врожденные нервной системы и адаптивные иммунные подмножества6,7,8,9. LPL состоят из CD4и CD8 Т-клеток в приблизительном соотношении 2:1, плазматические клетки и миелоидные клетки линии, включая, дендритные клетки, тучные клетки, эозинофилы и макрофаги6.
Существует растущий интерес к пониманию иммунной дисрегуляции и воспаления кишечника, как это относится к различным состояниям заболевания. Такие условия, как болезнь Крона и язвенный колит все проявляются различные уровни воспаления толстой кишки10,11,12. Кроме того, у пациентов со злокачественными или незлокачественными расстройствами костного мозга или иммунной системы, которые проходят аллогенную трансплантацию костного мозга (алло-БМТ), могут развиться различные формы колита, включая 1) прямую токсичность от схем кондиционирования до BMT, 2) инфекций, вызванных иммуносупрессией после BMT и 3) трансплантата против хозяина болезни (GVHD) обусловлен донора типа Т-клеток, реагирующих на донора алло-антигенов в тканях после BMT13,14,15. Все эти пост-BmT осложнений приводят к значительным изменениям в иммунной среде кишечника16,17,18. Предлагаемый метод позволяет надежную оценку накопления иммунных клеток в толстой кишке мыши и, при применении к получателям мурина после BMT, облегчает эффективное анализ как донора, так и реципиента иммунных клеток, участвующих в переноске трансплантации19 ,20. Дополнительные причины воспаления кишечника включают злокачественные новообразования, пищевую аллергию или нарушение микрофлоры кишечника. Этот протокол позволяет получить доступ к кишечной моноядерной клетке из толстой кишки и, с модификациями, к лейкоцитам тонкой кишки в любой из этих доклинических моделей мурин.
Поиск PubMed с использованием поисковых терминов “intestine And immune cell And isolation” показывает более 200 публикаций, описывающих методы пищеварения тонкой кишки для извлечения иммунных клеток. Однако, подобный поиск словесности для двоеточия не дает никакие well-delineated протоколы определяя изоляцию иммунных клеток от двоеточия. Это может быть потому, что двоеточие имеет более мышечной и интерстициальной слоев, что делает его более трудным для полного переваривания, чем тонкой кишки. В отличие от существующих протоколов, этот протокол специально использует Коллагеназа E от Clostridium histolyticum без других бактериальных коллагенезов (Collagenase D/ Коллагеназа I). Мы демонстрируем, что, используя этот протокол, пищеварение толстой ткани может быть достигнуто при сохранении качества изолированных кишечных моноядерных иммунных клеток (MNC) без добавления анти-слипающихся реагентов, таких как версенат натрия (EDTA), Dispase II, и дезоксирибонуклеэI (DNAse I)21,22,23. Этот протокол оптимизирован, чтобы позволить воспроизводимой надежной добычи жизнеспособной MNC из толстой кишки для дальнейших направленных исследований и должны поддаваться на изучение иммунологии толстой кишки или (с модификациями) тонкой кишки24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот визуальный протокол описывает хорошо переносимые методы изоляции моноядерных клеток толстой кишки, включая лиминпрорийские лимфоциты (LPL). Учитывая, что этот протокол был оптимизирован в оценке тяжелых посттрансплантационных моделей мышь колит, где воспалительные цитокины и тра…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами #1K08HL088260 и #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.) и Фондом детских исследований Батчелора (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Мыши C57BL/6 и BALB/c, используемые в этом исследовании, были либо выведены в нашем учреждении, либо предоставлены Jackson Labs или Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
Riferimenti
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
