Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E
Summary
Le but de ce protocole est d’isoler les cellules mononucléaires qui résident dans la lamina propria du côlon par digestion enzymatique du tissu à l’aide de collagène. Ce protocole permet l’isolement efficace des cellules mononucléaires résultant en une suspension de cellules simples qui à son tour peut être utilisé pour l’immunophénotypage robuste.
Abstract
L’intestin est la maison au plus grand nombre de cellules immunitaires dans le corps. Les petits et grands systèmes immunitaires intestinaux police l’exposition aux antigènes exogènes et modulent les réponses à de puissants stimuli immunitaires microbiens dérivés. Pour cette raison, l’intestin est un site cible principal de la dysrégulation immunitaire et de l’inflammation dans beaucoup de maladies comprenant mais, non limité aux maladies inflammatoires d’entrailles telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) après os greffe de moelle (BMT), et de nombreuses conditions allergiques et infectieuses. Les modèles murines de l’inflammation gastro-intestinale et de la colite sont fortement employés pour étudier des complications de GI et pour optimiser précliniquement des stratégies pour la prévention et le traitement. Les données glanées à partir de ces modèles par l’intermédiaire de l’isolement et de l’analyse phénotypique des cellules immunitaires de l’intestin sont essentielles à une compréhension immunitaire plus poussée qui peut être appliquée pour améliorer les troubles gastro-intestinaux et inflammatoires systémiques. Ce rapport décrit un protocole très efficace pour l’isolement des cellules mononucléaires (MNC) du côlon utilisant une interface mélangée de gradient de densité de silice-basée. Cette méthode isole reproductiblement un nombre significatif de leucocytes viables tout en minimisant les débris contaminants, permettant le phénotypage immunitaire ultérieur par cytométrie d’écoulement ou d’autres méthodes.
Introduction
Bien que le tractus gastro-intestinal (GI) soit principalement dédié au traitement et à la réabsorption des nutriments des aliments, le tractus gastro-intestinal maintient également des rôles centraux dans l’intégrité des systèmes vasculaires, lymphatiques et nerveux et de nombreux autres organes par son système immunitaire muqueux et submucosal1. Le système immunitaire gastro-intestinal et systémique a un rôle influent en raison de son exposition constante à des antigènes étrangers provenant d’aliments, de bactéries commensales ou d’agents pathogènes envahissants1,2. Ainsi, le système immunitaire GASTRO doit maintenir un équilibre délicat dans lequel il tolère les antigènes non pathogènes tout en répondant de manière appropriée aux antigènes pathogènes1,2. Lorsque l’équilibre de la tolérance et de la défense est perturbé, la dysrégulation immunitaire localisée ou systémique et l’inflammation peuvent se produire résultant en une myriade de maladies1,2,3.
L’intestin abrite au moins 70% de toutes les cellules lymphoïdes dans le corps4. La plupart des interactions immunologiques primaires impliquent au moins une des trois stations immunitaires dans l’intestin : 1) Patchs de Peyer, 2) lymphocytes intraépithélial (IEL) et 3) lymphocytes lamina propria (LPL). Chacun d’eux est composé d’un réseau complexe interconnecté de cellules immunitaires qui répondent rapidement aux défis immunitaires normaux dans l’intestin5. Limité au stroma au-dessus de la muqueuse musculaire, la propria lamina vaguement structurée est le tissu conjonctif de la muqueuse intestinale et comprend l’échafaudage pour le villus, la vascularisation, le drainage lymphatique, et le système nerveux muqueux, ainsi que de nombreux innés et les sous-ensembles immunitaires adaptatifs6,7,8,9. LPL sont composés de CD4et CD8– lymphocytes T dans un rapport approximatif de 2:1, les cellules plasmatiques et les cellules de lignée myéloïde, y compris, les cellules dendritiques, les mastocytes, les éosinophiles et les macrophages6.
Il y a un intérêt croissant dans la compréhension de la dysrégulation immunisée et de l’inflammation de l’intestin en ce qui concerne divers états de la maladie. Des conditions telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse se manifestent toutes de différents niveaux d’inflammation du côlon10,11,12. En outre, les patients présentant des troubles malins ou non malins de la moelle ou du système immunitaire qui subissent une transplantation allogénique de moelle (allo-BMT) peuvent développer diverses formes de colite comprenant 1) toxicité directe des régimes de conditionnement avant BMT, 2) infections provoquées par immunosuppression après BMT et 3 la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD) conduite par les cellules T de distributeur-type réagissant aux allo-antigènes de distributeur dans les tissus après BMT13,14,15. Toutes ces complications post-BMT entraînent des altérations significatives dans le milieu immunitaire des intestins16,17,18. La méthode proposée permet une évaluation fiable de l’accumulation des cellules immunitaires dans le côlon de la souris et, lorsqu’elle est appliquée aux receveurs de murine après bMT, facilite un test efficace des cellules immunitaires des donneurs et des receveurs impliqués dans la tolérance à la greffe19 ,20. D’autres causes de l’inflammation intestinale incluent des malignités, des allergies alimentaires, ou une perturbation du microbiome intestinal. Ce protocole permet l’accès des cellules mononucléaires intestinales du côlon et, avec des modifications, aux leucocytes de l’intestin grêle dans l’un de ces modèles précliniques de murine.
Une recherche PubMed utilisant les termes de recherche “intestin ET cellule immunitaire ET isolement” révèle plus de 200 publications décrivant les méthodes de digestion de l’intestin grêle pour extraire les cellules immunitaires. Cependant, une recherche semblable de littérature pour le côlon ne donne aucun protocole bien délimité spécifiant l’isolement des cellules immunitaires du côlon. C’est peut-être parce que le côlon a plus de couches musculaires et interstitielles, ce qui le rend plus difficile à digérer complètement que l’intestin grêle. Contrairement aux protocoles existants, ce protocole utilise spécifiquement la collagène E de Clostridium histolyticum sans autres collagènes bactériens (Collagenase D/ Collagenase I). Nous démontrons que, utilisant ce protocole, la digestion du tissu colonique peut être réalisée tout en préservant la qualité des cellules immunitaires mononucléaires d’intestin d’isolement (MNC) sans l’addition des réactifs anti-clumping tels que le versenate de sodium (EDTA), Dispase II, et deoxyribonuclease I (DNAse I)21,22,23. Ce protocole est optimisé pour permettre l’extraction robuste reproductible de MNC viable du côlon murine pour d’autres études dirigées et devrait se prêter à l’étude de l’immunologie du côlon ou (avec des modifications) l’intestin grêle24, 25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole visuel décrit des méthodes bien tolérées pour l’isolement des cellules mononucléaires du côlon, y compris les lymphocytes lamina propria (LPL). Étant donné que ce protocole a été optimisé dans l’évaluation des modèles graves de colite de souris post-transplantation où les cytokines inflammatoires et les lésions tissulaires se prêtent à une faible viabilité de la MNC récupérée, nous prévoyons que ces méthodes peuvent être traduites à d’autres applications nécessitant une analyse phé…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par des subventions #1K08HL088260 et #1R01HL133462-01A1 (NHLBI) (A.B.P., H.N., S.J.), et la Batchelor Foundation for Pediatric Research (D.M., H.N., S.J., A.A.H., A.B.P.). Les souris C57BL/6 et BALB/c utilisées dans cette étude ont été élevées dans notre établissement ou fournies par Jackson Labs ou Taconic.
Materials
| 60 mm Petri DIsh | Thermo Scientific | 150288 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 10x PBS | Lonza BioWhittaker | BW17-517Q | |
| 10 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4100 | |
| 10mL Syringe | Becton Dickinson | 302995 | |
| 15mL Non-Sterile Conical Tubes | TruLine | TR2002 | |
| 18- gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 305180 | |
| 25 mL Disposable Serological Pipette | Corning | 4250 | |
| 40 micrometer pore size Cell Strainer | Corning | 352340 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning | 21008-951 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503-1KG | |
| Fixation Buffer | Biolegend | 420801 | |
| E. coli Collagenase E from Clostridium histolyticum | Sigma | C2139 | |
| EDTA, 0.5M Sterile Solution | Amresco | E177-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo /Fisher Scientific -HyCLone | SV30014.03 | |
| HEPES | GE Healthcare-HyClone | SH30237.01 | |
| Percoll | GE Healthcare-Life Sciences | 1708901 | |
| RPMI Medium | Corning | 17-105-CV | |
| Sodium Azide | VWR Life Science Amresco | 97064-646 | |
| Trypan Blue | Lonza BioWhittaker | 17-942E |
Riferimenti
- Schneeman, B. Gastrointestinal physiology and functions. British Journal of Nutrition. 88, S159-S163 (2002).
- Arranz, E., Pena, A. S., Bernardo, D. Mediators of inflammation and immune responses in the human gastrointestinal tract. Mediators of inflammation. 2013, 1-3 (2013).
- Blumberg, R. S. Inflammation in the intestinal tract: pathogenesis and treatment. Digestive diseases. 27 (4), 455-464 (2009).
- Pabst, R., Russell, M. W., Brandtzaeg, P. Tissue Distribution of Lymphocytes and Plasma Cells and the Role of the Gut. Trends in Immunology. 29 (5), 206-208 (2008).
- Reibig, S., Hackenbrunch, C., Hovelmeyer, N., Waisman, A., Becher, B. Isolation of T Cells from the Gut. T-Helper Cells: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-25 (2014).
- Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional Specialization within the Intestinal Immune System. Nature Reviews Immunology. 14 (10), 667-685 (2014).
- Brandtzaeg, P., Kiyono, H., Pabst, R., Russell, M. W. Terminology: Nomenclature of mucosa-associated lymphoid tissue. Mucosal Immunology. 1 (1), 31-37 (2008).
- Schieferdecker, H. L., Ullrich, R., Hirseland, H., Zeitz, M. T cell differentiation antigens on lymphocytes in the human intestinal lamina propria. Journal of Immunology. 148 (8), 2816-2822 (1992).
- Mowat, A. M., Viney, J. L. The anatomical basis of intestinal immunity. Immunological Reviews. 156, 145-166 (1997).
- Ford, A. C., Lacy, B. E., Talley, N. J. Irritable Bowel Syndrome. The New England Journal of Medicine. 376 (26), 2566-2578 (2017).
- Harb, W. J. Crohn’s Disease of the Colon, Rectum, and Anus. Surgical Clinics of North America. 95 (6), 1195-1210 (2015).
- Ungaro, R., Mehandru, S., Allen, P. B., Pyrin-Biroulet, L., Colombel, J. F. Ulcerative Colitis. The Lancet. 389 (10080), 1756-1770 (2017).
- Mohty, B., Mohty, M. Long-term complications and side effects after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: an update. Blood cancer journal. 1 (4), 1-5 (2011).
- Hatzimichael, E., Tuthill, M. Hematopoietic stem cell transplantation. Stem cells and cloning: advances and applications. 3, 105-117 (2010).
- Hernandez-Margo, P. M., et al. Colonic Complications Following Human Bone Marrow Transplantation. Journal of Coloproctology. 35 (1), 46-52 (2015).
- Del Campo, L., Leon, N. G., Palacios, D. C., Lagana, C., Tagarro, D. Abdominal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation. Radio Graphics. 34 (2), 396-412 (2014).
- Lee, J., Lim, G., Im, S., Chung, N., Hahn, S. Gastrointestinal Complications Following Hematopoietic Stem Cell Transplantation in Children. Korean Journal of Radiology. 9 (5), 449-457 (2008).
- Takatsuka, H., Iwasaki, T., Okamoto, T., Kakishita, E. Intestinal Graft-Versus-Host Disease: Mechanisms and Management. Drugs. 63 (1), 1-15 (2003).
- Shuyu, E., et al. Bidirectional immune tolerance in nonmyeloablative MHC-mismatched BMT for murine β-thalassemia. Blood. 129 (22), 3017-3030 (2017).
- van der Merwe, M., et al. Recipient myeloid-derived immunomodulatory cells induce PD-1 ligand-dependent donor CD4+Foxp3+ regulatory T cell proliferation and donor-recipient immune tolerance after murine nonmyeloablative bone marrow transplantation. Journal of Immunology. 191 (11), 5764-5776 (2013).
- Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (111), e54114 (2016).
- Qiu, Z., Sheridan, B. S. Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System. Journal of Visualized Experiments. (132), e57281 (2018).
- Weigmann, B. Isolation and subsequent analysis of murine lamina propria mononuclear cells from colonic tissue. Nature Protocols. 2, 2307-2311 (2007).
- Bull, D. M., Bookman, M. A. Isolation and functional characterization of human intestinal mucosal lymphoid cells. Journal of Clinical Investigation. 59 (5), 966-974 (1977).
- Davies, M. D., Parrott, D. M. Preparation and purification of lymphocytes from the epithelium and lamina propria of murine small intestine. Gut. 22, 481-488 (1981).
- Carrasco, A., et al. Comparison of Lymphocyte Isolation Methods for Endoscopic Biopsy Specimens from the Colonic Mucosa. Journal of Immunological Methods. 389 (1-2), 29-37 (2013).
- Zhang, Y., Ran, L., Li, C., Chen, X. Diversity, Structures, and Collagen-Degrading Mechanisms of Bacterial Collagenolytic Proteases. Applied and Environmental Microbiology. 81 (18), 6098-6107 (2015).
- Harrington, D. J. Bacterial collagenases and collagen-degrading enzymes and their potential role in human disease. Infection and immunity. 64 (6), 1885-1891 (1996).
- Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases – A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2014).
- Autengruber, A., et al. Impact of Enzymatic Tissue Disintegration on the Level of Surface Molecule Expression and Immune Cell Function. European Journal of Microbiology and Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of Murine Small Intestine Leukocyte Isolation for Global Immune Phenotype Analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- van der Heijden, P. j., Stok, W. Improved Procedure for the Isolation of Functionally Active Lymphoid Cells from the Murine Intestine. Journal of Immunological Methods. 3 (2), 161-167 (1987).
