Undersökning av mitotiska och Meiotic fission jäst nukleär dynamik genom fluorescens Live-cell Microscopy

Summary

Här presenterar vi Live-cell Imaging som är en giftfri mikroskopi metod som gör det möjligt för forskare att studera protein beteende och nukleär dynamik i levande fission jästceller under Mitos och meiosis.

Abstract

Live-cell Imaging är en mikroskopi teknik som används för att undersöka cell-och proteindynamik i levande celler. Denna avbildning metod är inte giftigt, i allmänhet inte stör cellfysiologi, och kräver minimal experimentell hantering. De låga nivåerna av tekniska störningar gör det möjligt för forskare att studera celler över flera cykler av Mitos och att iaktta meios från början till. Med hjälp av fluorescerande taggar som grönt fluorescerande protein (GFP) och rött fluorescerande protein (RFP), forskare kan analysera olika faktorer vars funktioner är viktiga för processer som transkription, DNA-replikering, sammanhållning, och segregation. Tillsammans med dataanalys med Fiji (en fri, optimerad ImageJ version), erbjuder live-cell Imaging olika sätt att bedöma protein rörelser, lokalisering, stabilitet och timing, samt nukleär dynamik och kromosom segregering. Men som är fallet med andra mikroskopi metoder, Live-cell Imaging begränsas av inneboende egenskaper av ljus, som sätter en gräns för upplösningen makt vid höga förstoringar, och är också känslig för foto blekning eller fototoxicitet vid hög våglängd Frekvenser. Men med viss omsorg, utredare kan kringgå dessa fysiska begränsningar genom att noggrant välja rätt villkor, stammar, och fluorescerande markörer för att möjliggöra en lämplig visualisering av mitotiska och meiotiska händelser.

Introduction

Live-cell Mikroskop gör det möjligt för forskare att undersöka kärnkrafts dynamik utan att döda fission jästceller och eliminerar behovet av dödliga fixeringsmedel och fläckar. Det är möjligt att iaktta stabilitet, rörelse, lokalisering och timing av fluorescerande märkta proteiner som är involverade i viktiga händelser såsom kromosom replikation, rekombination och segregering, utöver membranet och cytoskeletala Rörelser. Genom att bibehålla cellernas genomförbarhet och giftfri signaldetektering finns minimalt fysiologiskt intrång. När den utförs på rätt sätt, kan denna mikroskopi metod minska störande effekter som uppstår från den utökade tekniska hanteringen eller från falsk kemisk reaktivitet. Dessutom, under ett experiment, forskare kan göra relevanta observationer av fission jäst näringsmässiga och stress stater, proliferativ effektivitet, och apoptotiska status som indikerar olämpliga Imaging parametrar eller onormal cellfysiologi^{1 ,2,3}.

Mitos och meios kännetecknas av nukleär och cellulära division. I meiosis, i motsats till Mitos, är genetiskt innehåll halveras som föräldra celler ger upphov till dotterceller⁴. Eftersom levande cell avbildning ger en tidsmässig dimension utöver den rumsliga relationen, kan ett stort antal celler undersökas i realtid. Live-cell mikroskopi har gjort det möjligt för forskare att undersöka dynamiken i kärnkraft division med hjälp av fluorescerande taggar för histoner⁵, sammanhållande subenheter⁶, mikrotubuli⁷, centromerer⁸, kinetochores⁹, komponenter i spindeln Pole Body (SPB)¹⁰, och de av kromosom passagerar komplexet (CPC)¹¹. Utanför kromosom segregering apparat, levande-cell Imaging har också fångat beteendet hos proteiner som behövs, men inte direkt inblandade i kromosom segregering. Funktionen av dessa proteiner har visat sig påverka replikering, kromosom rekombination, nukleär rörelse, och kromosom fastsättning till mikrotubuli^12,13,14. Dessa observationer har bidragit till en bättre förståelse av cellulära händelser vars funktionella komponenter inte var mottagliga för biokemiska eller genetisk undersökning. Med nya framsteg inom mikroskopi teknik, begränsningar såsom dålig upplösning, Foto blekning, fototoxicitet och fokus stabilitet kommer att minska, vilket underlättar bättre realtid observationer av mitotiska och meiotiska nukleära dynamik^{1, 2,3}. Meiosis är särskilt utmanande eftersom det är en Terminal differentiering väg som kräver noggrann uppmärksamhet på timing.

Målet med detta protokoll är att presentera en relativt enkel metod för att undersöka realtids-fission jäst nukleär dynamik i Mitos och meiosis. För att åstadkomma detta, är det nödvändigt att använda celler som inte har utsatts för miljö stress, förbereda aguppstod kuddar som tål långvarig avbildning, och montera celler på densiteter som underlättar visualisering av encellig dynamik. Dessutom utnyttjar detta protokoll celler som transporterar Fluorescent taggade proteiner som fungerar som användbara markörer för nukleär kinetik (Hht1-MRFP eller Hht1-GFP), kromosom segregering (Sad1-dsred), cytoskelettet Dynamics (Atb2-MRFP), transkriptionella aktivering i G1/S (Tos4-GFP) och sammanhållning stabilitet i meios (Rec8-GFP). Denna metod introducerar också ytterligare nukleära och cytosoliska markörer (tabell I) som kan användas i olika kombinationer för att hantera frågor om specifika cellulära processer. Dessutom, grundläggande Fiji verktyg är skisserat för att hjälpa forskare att bearbeta levande cell bilder och analysera olika typer av data. Styrkan i denna strategi härrör från användningen av realtid observationer av proteindynamik, timing, och stabilitet för att beskriva processer som är integrerad för korrekt genomförande av Mitos och meiosis.

Protocol

1. förberedelse av media15,16 Lagerlösningar Förbered en 50x salt lagerlösning genom att tillsätta 52,5 g MgCl2· 6H20, 0,735 g av CaCl2· 2H20, 50 g KCL, och 2 g na2S04 i en flaska som innehåller 1 L destillerat vatten. Blanda lösningen grundligt och sterilisera genom filtrering. Plats vid 4 ° c för långtidsförvaring. Gör en 1000X vitamin stamlösning genom att blanda 1 g pantotensyra, 10 g nikotinsyra, 10 g inositol, och 10 mg biotin i en flaska som innehåller 1 L destillerat vatten. Blanda lösningen väl och sterilisera genom filtrering. Förvaras vid 4 ° c för långtidsförvaring. Förbered en 10, 000x mineral lagerlösning genom att tillsätta 5 g borsyra, 4 g MnSO4, 4 g av znso4· 7h2o, 2 g FeCl2· 6h2o, 1 g KI, 0,4 g av molybden syra, 0,4 g CuSO4· 5H20 och 10 g citronsyra i en flaska innehållande 1 liter destillerat vatten. Blanda lösningen grundligt och sterilisera genom filtrering. Plats vid 4 ° c för långtidsförvaring. Gör enskilda näringsämnen lagerlösningar genom att tillsätta 7,5 g antingen adenin, leucin, histidin eller lysin i en flaska som innehåller 1 L destillerat vatten. Använd endast 3,75 g för att göra uracil-lösningen. Sterilisera lösningar genom autoklavering.Anmärkning: Med tiden fälls uracil ut ur lösningen. För att ta in lösningen igen, värm i mikrovågsugnen vid 60% effekt i 10 s steg eller placera i en 55 ° c vattenbad för 20 min. snurra den varma lösningen tills alla uracil klumpar försvinna. Jästextrakt plus kosttillskott (Ja) Tillsätt 1 liter destillerat vatten i en 2 L-kolv, 5 g jästextrakt, 30 g glukos och 225 mg vardera av adenin, uracil, L-histidin, L-leucin och L-lysin. Tillsätt 20 g agar för att göra det fasta mediet. Använd en magnetisk rör bar för att helt lösa upp ingredienserna i lösningen. Agar smälter efter att mediet har steriliserats genom autoklav.Anmärkning: För enkelhetens skull, klar att använda Ja pulver är också kommersiellt tillgängliga. Edinburgh minimal medium (EMM) och pombe glutamat medium (PMG) I en 2 L kolv, kombinera 1 L destillerat vatten med 3 g kaliumväteftalat, 2,2 g na2HPO4,5g NH4cl, 20 g glukos, 20 mL salt stamlösning, 1 ml vitamin stamlösning , och 0,1 mL mineral stamlösning. Ersätt NH4Cl med 2,2 g L-glutaminsyra monokatrium salt för att förbereda PMG. För att göra det fasta mediet, tillsätt 20 g agar. Använd en magnetisk rör bar, lös upp ingredienserna grundligt. Agar smälter efter att mediet har steriliserats genom autoklav. Innan användning, tillsätt näringsämnen lagerlösningar efter behov. För varje 1 L medium, tillsätt 15 mL vardera av adenin, leucin, histidin, och lysin. Använd 30 mL för uracil, eftersom det är mindre koncentrerad än de andra näringslösningar.Anmärkning: För enkelhetens skull, är färdiga att använda EMM och PMG pulver också kommersiellt tillgängliga. Malt extrakt (mig) Använd en 2 L-kolv för att blanda 1 L destillerat vatten med 30 g maltextrakt och 225 mg vardera av adenin, uracil, histidin och leucin. Justera pH till 5,5. Inkludera 20 g agar för att göra det fasta mediet. Lös upp komponenterna i lösningen med hjälp av en magnetisk rör stång. Agar smälter efter att mediet har steriliserats genom autoklav. Sporulation agar med kosttillskott (Spa) Tillsätt 1 liter destillerat vatten i en 2 L kolv, 10 g glukos, 1 g KH2Po4, 1 mL vitamin buljong, 45 mg vardera av adenin, uracil, histidin, leucin och lysin hydroklorid. Tillsätt 20 g agar för att göra det fasta mediet. Använd en magnetisk rör bar för att grundligt kombinera ingredienser. Agar smälter efter att mediet har steriliserats genom autoklav. 2. fission jäst kultur15,16 Använd Ja fast medium för att väcka fission jäststammar från kryogen konservering. Beroende på temperaturkraven för varje stam, inkubera vid antingen 25 ° c eller 32 ° c under 3-5 dagar. När kolonier är synliga, Förbered en förrätt flytande kultur. Plocka celler från enskilda kolonier och Inokulera dem i provrör som innehåller 3 mL Ja flytande medium. Växa vid lämplig temperatur till mitten-eller sen-log fas.Anmärkning: För korrekt luftning, Använd rör eller flaskor med volymer som är minst 5x större än den avsedda vätske odlings volymen. Skakhastigheter mellan 150-220 RPM är brukligt för rutinmässig kultur tillväxt. Fördela 250-500 μL startkultur i en 50 mL kolv som innehåller 9,5-9.75 mL av antingen ja, EMM eller PMG plus lämpliga kosttillskott. Tillåt celler att växa till önskad densitet och kontrollera under mikroskopet för korrekt cellmorfologi och näringstillstånd.Anmärkning: För att lagra vaknat stammar i upp till en månad, tätning Ja plattor med paraffin tejp och plats vid 4 ° c. 3. provberedning2 Inställning av Mikroskop bild Tillsätt 2 g aguppstod i en 500 mL-bägare innehållande 100 mL av antingen minimalt medium plus tillskott (Mitos) eller flytande Spa (meiosis). Värm aguppstod lösningen i en mikrovågsugn på 60% effekt i 10 s steg eller placera i en 55 ° c vattenbad i 10 min. snurra lösningen för att säkerställa en effektiv smältning. Förbered aguppstod Slide-Making Setup (figur 1a) för att säkerställa snabb pad förberedelse och förhindra smält Agreste från stelnar i förtid. Låt smält agasen svalna i 1 min vid rumstemperatur och fördela 50-100 μL fläckar på Mikroskop rutschbanor med hjälp av breda pipettspetsar. Innan Agam kyls ner, placera ett Mikroskop glida på toppen för att generera en spread pad av ca 1,5-2 cm i diameter (figur 1b-C). Bredden på aguppstod pad är vanligtvis proportionell mot längden på Imaging tid. Med andra ord tål tjockare kuddar längre bild perioder. Använd en kolväteblandning som ett tätningsmedel för att säkerställa korrekt täckning av diabilder med tjocka agantramp och för att förhindra celldöd från lösningsmedels exponering vid täckglas kanterna. Blanda lika delar (w/w) av vaselin, Lanolin och paraffin i en 500 mL bägare. Värm ingredienserna på en värmeplatta vid 120 ° c i 5 min. Som komponenter smälta, försiktigt snurra den smälta lösningen för att säkerställa lämplig blandning. Exempel på Inställningar För undersökning av mitotiska händelser, växa celler från starter kulturer i antingen flytande EMM eller PMG plus kosttillskott till ungefär Mid-log fas (OD595 av 0,4). Centrifugera 1 mL av cellsuspensionen vid 1 375 x g i 1 min, ta bort supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i det minimala mediet plus tillskott till en slutlig volym på 100 μl. Till bild meiotiska händelser, växa celler från starter kulturer i minimal medium plus tillskott till sena-log fas (OD595 av 0.7-1.0). Kombinera lika volymer av motsatta Mate-typ celler (h- och h+) i en 1 ml cellsuspension. Centrifugera celler vid 1 375 x g i 1 min och Omsuspendera pelleten i flytande me. Upprepa detta steg tre gånger för att säkerställa effektiv näringsämne avlägsnande. Efter den sista mig tvätta, Omsuspendera celler i 1 mL av mig och tillsätt den till en 50 mL kolv innehållande 9 mL ME. Inkubera i 12-16 h vid 22-25 ° c på minimal rotationshastighet (50-100 RPM). Riklig cell floculation, vilket resulterar i många runda fission jäst klumpar och indikerar effektiv parning. Ta 1 mL prov av parnings kulturen och centrifugera vid 1 375 x g i 1 min. eliminera supernatanten men lämna 250 μl i röret för att Omsuspendera celler. Innan du placerar celler på agantramp kuddar, Vortex kraftigt för 5 s att störa klumpar.Anmärkning: De återstående 250 μL mig som används för att Omsuspendera celler innehåller parnings faktorer som hjälper celler in meiosis. Placera 20 μl av antingen en mitotisk eller meiotiska metafaserna cellsuspension på en 2% agastinpad. Ta bort överflödigt medium genom att invertera bilden och sätta den på toppen av en luddfri pappershandduk för 2-3 s (figur 1d). Ställ in glid dynan uppåt och placera försiktigt ett glastäckglas så att du inte genererar luftbubblor (figur 1f).Anmärkning: Eliminera överflödigt medium med en pappershandduk är mer tidseffektiv än gravitation absorption, vilket är särskilt viktigt i meios experiment. För att skapa en cellmonolayer, rotera täckslip medurs med pekfingret för en (mitosis) eller två (meiosis) full svängar (figur 1f). Se till att cellen materia skingrar över aguppstod pad möjliggör bättre separation av enskilda celler eller ASCI. Med hjälp av en liten träpinne, fördela smält tätningsmedel längs kanterna på täckglas för att täta varje Agros pad (figur 1G). När Agam pad är förseglad, placera den på mikroskopet scenen och låt den jämvikt för 10-15 min vid lämplig avbildning förhållanden (t. ex. temperatur) (figur 1H) för att luftbubblor att försvinna och låta någon sista-minuten aguppstod skiftar inträffa. Börja avbilda när bilden är effektivt jämställas och ta inte bort den från scenen tills datainsamlingen avslutas.Anmärkning: Kontroll av temperatur och luftfuktighet bestäms av det mikroskopsystem som används och specifika experimentella krav. Om det finns, tillämpa temperatur och luftfuktighet kontroll på alla bild experiment. Om frånvarande, forskare måste utforma ett sätt att förhindra temperaturvariationer, särskilt under meios experiment. 4. live-cell Imaging2 och bearbetning Använd 40x-målet för att hitta lämpliga visningsfält för bilden. Växla till målet 60x att påbörja datainsamling. Beroende på vilket Mikroskop system som används, kommer efterföljande omfokusering och snittning på provet vid varje tidpunkt att ske manuellt eller genom en Mikroskop-eller mjukvaruautomatiserad process.Anmärkning: De bilder som presenteras i detta protokoll samlades in med hjälp av en deconvolution, fluorescens Mikroskop utrustad med sedat, RFP och GFP filteruppsättningar, nano-motion skede, 60x NA 1,4 objektiv objektiv och 12-bitars CCD-kamera. Inbyggda mekaniska jalusier och motordrivna Filterhjul tillåts för minskad exciteringsexponering och fotoblekning av prover. Använd lämplig programvara för att hämta och bearbeta bilder. Att deconvolve bilder, anställa tillverkarens tillhandahållna optiska överförings funktioner.Anmärkning: För mer information om Mikroskop utrustningen och programvaran som används i detta protokoll, se material tabellen. För att använda en konventionell fluorescens Mikroskop för att förvärva levande-cell bilder se till att mikroskopet samlar in data digitalt, har 40x eller 60x mål med numeriska öppningar (NA) större än 1,2, och kan utföra optisk snittning.Anmärkning: Utan dessa krav, bilder kommer att visa minskad upplösning, äventyra kvaliteten på mikroskopiska mätningar och kvalitativa observationer. Använd gratis plug-in program (t. ex., Fiji) för att minimera systematiska oskärpa fel som uppstår från kontrast förlusten under bild förvärvet17,18,19,20 och för att säkerställa en korrekt kvantitativ analys fluorescensintensiteten och andra tidsmässiga och dynamiska händelser i cellen.Anmärkning: Andra tillgängliga kommersiella deconvolution program kan hittas i tabellen av material. Välj de Mikroskop filteruppsättningar som bäst matchar fluoroforer under observation. Se till att excitation och utsläpp filter har rätt band passerar som möjliggör specifik detektion av fluorescerande proteiner. Till exempel, för att upptäcka GFP signal, en excitation och emission band passera 430/25 och 470/30 är lämpligt, men inte för RFP fluorescens. Använd en minimal-effektiv-inställningar Approach (MESA) vid avbildning fission jäst vid flera tidpunkter. Med andra ord, undvika långvarig användning av excitation våglängder och anställa den lägsta excitation makt och exponeringstid som genererar godtagbara, men kvantifierbara och reproducerbara Imaging data. För långvarig avbildning under Mitos eller meiosis, begränsa intervallet mellan förvärvs tiden pekar på 5-10 min. Även om 2% aguppstod kuddar kan motstå 12 till 16 h bildbehandlings sessioner, cell-växling på grund av aguppstod avdunstning är sannolikt. Därför, utföra full Mitos eller meios experiment i 4-6 h eller 8-10 h fönster, respektive. Samla in avbildningsdata för 4-8 h som består av minst 24-48 förvärvs tidpunkter, ett fluorescensprotein och en z-stack per tidpunkt och fluorescerande kanal bestående av 13 sektioner med ett mellanrum på 0,5 μm med ett 60x-objektiv. Detta kräver minst 0,5-1 GB lagringsutrymme på hårddisken. Därför, förutom att eliminera photoblekning och cell-shifting, skapa ett arbetsflöde som beaktar datorkapacitet1,2,3.Anmärkning: Dessa förvärvs parametrar är vanligtvis inställda och modifierade i programvaran som styr Mikroskop funktioner och som samlar in och bearbetar bilder. För att närmare undersöka specifika kärnkrafts processer, utför bild förvärv var 5-10 s, så länge som utsläppet inte minskar väsentligt efter frekvent exponering. Utföra en preliminär fluorescensintensitetsanalys under olika tidsperioder för att fastställa den punkt efter vilken noggrannheten hos insamlade data inte längre är tillförlitlig1,3. I bild-förvärv och bild-bearbetning programvara, använda maximal intensitet projektion på bilden z-stackar att iaktta alla strukturer med hög fluorescens densitet på ett 2D-plan oavsett deras vertikala plats1,2, 3. Detta underlättar en snabb undersökning av kärnprocesser som förekommer i olika voxels. Samla en mid-Focal ljust fält bild för att generera en referensbild av cellerna under observation. 5. imageanalysis20,21 Anmärkning: Bildanalys i detta protokoll utförs med Fiji. För andra analysprogram och Fiji plug-ins se tabell över material. Ladda upp en deconvolved bild genom att välja bio-format importör funktionen under plugins menyn. I popup-fönstret import alternativ väljer du hyperstack, standardfärg lägeoch kontrollerar autoskalning innan du trycker på OK -knappen. Se till att fönstret som visas har rätt antal fluorescens kanaler och tidsramar genom att bläddra i sidled på respektive staplar längst ner. Spara som en TIFF-fil, som inte komprimerar data och förhindrar informationsförlust. Öppna en bild som innehåller en skalstapel som genererats under databearbetningen av Mikroskop programvaran. Bestäm pixel längden för skalstapeln med hjälp av det raka linjeverktyget för att rita en parallell linje av samma storlek och välj Mät på analysera-menyn. Lägg till ett skalningsfält genom att ställa in bildens pixel-till-μm-förhållande genom att välja ange skala på menyn analysera. I popup-fönstret Ange skala anger du det beräknade avståndet i pixlar och känt avstånd i μm, anger pixelproportionerna till 1,0, sätter micron som längdenhetoch markerar den globala rutan innan du klickar på OK -knappen. Använd alternativet Ange mått under menyn analysera för att välja olika parametrar som ska kvantifiera vid val av mått. I det här protokollet väljer du följande mätvärden: område, omkrets, medelvärde gråvärde, median, min & Max grått värde, integrerad densitet, stack positionoch Display etiketten. Beroende på precisionen för insamlade data anger du fler än 1 för alternativet decimal platser och markerar rutan matematisk notation om det behövs. När du har tillämpat kommandot mått visas ett resultat i popup-fönstret värdena för varje relevant parameter. Spara resultaten som en CSV-fil för framtida analys i ett statistik program.Anmärkning: Det är inte nödvändigt att separera en bild i dess ingående fluorescerande kanaler för att bestämma längden, om det inte finns signalinterferens mellan de olika färgerna i vilket fall Följ stegen nedan. När det gäller signalinterferens, Välj färg och kanaler verktyg från bild-menyn och analysera varje färg separat. Om du vill mäta längden på icke-linjära strukturer högerklickar du på linjeverktyget och använder alternativet segmenterad linje eller frihandslinje för att spåra önskade objekt. För linjära strukturer eller för att bestämma avståndet mellan två punkter, Använd den raka linjen funktionen och välj mått från analysera -menyn. Värden för längd i μm läggs automatiskt till de parametrar som tidigare valdes under alternativet Ställ in mätningar . För att mäta förändringar i signal storlek och fluorescensintensitet skapar du först ettROI-bibliotek (region of Interest), vilket ökar kvantifieringens noggrannhet och underlättar snabba mätningar i en bildstapel. Välj färg -och kanal verktyg under bild menyn. I popup-fönstret kanaler kontrollerar du den färgkanal för vilken intensitet eller område ska mätas. Välj funktionerna Justera och tröskelvärde under bild -menyn. Markera kryssrutan mörk bakgrund , Välj standard metod (om inte annat krävs av insamlade data) och plocka röd för att överlagra signalerna av intresse.Anmärkning: Mätning av proteiners stabilitet, rörelse och lokalisering är nära beroende av den färg tröskel som används för att skapa ROI-bibliotek. Det är viktigt att välja rätt tröskel metod för den typ av fluorescerande markör signal som ska visualiseras17,18. Använd verktyget trollspö för att markera varje intresse struktur och tryck på bokstaven T på tangentbordet för att lägga till den valda avkastningen i fönstret ROI Manager . Upprepa denna process för varje sektor (tidsram) i bildstapeln och lagra alla ROIs genom att klicka på knappen mer och välja Spara. Öppna den zippade ROI-mappen för att ladda ROI-hanteraren och klicka på varje ROI- identifierare på den vänstra sidopanelen. Välj mått på analysera -menyn och upprepa det här kommandot på varje ROI-identifierare för att kvantifiera objekt av intresse i alla segment i bildstapeln. Om cell växling inte är ett problem och fokalplanet förblir detsamma för alla segment i stacken klickar du på multi Measure i ROI-hanteraren. I popup-fönstret väljer du Mät alla segment i stället för en rad per segment för att iterera mätningar över bildstapeln. Spara resultaten som en CSV-fil och analysera mätningar i ett statistik program. För flera nukleära signaler som omfattar strukturen av intresse, tryck på SKIFT -tangenten medan du väljer objekt med trollspö för att skapa en enda ROI. Alternativt skapa en ROI av konstant storlek med oval verktyg för att omfatta alla signaler av intresse.Anmärkning: Detta ovala tillvägagångssätt kan vara nödvändigt för att mäta och beskriva signal beteendet över ett område där fluorescenssignalen ändras i storlek och intensitet över tid. Signalintensitet, i detta fall, är den genomsnittliga signal tätheten över ett givet område. Kvalitativt bestämma samlokalisering av två fluorescerande signaler genom att ändra färg på signalen överlappar regionen. Men eftersom samlokalisering zonen smalnar, är det svårare att skilja signal överlappning. I det här fallet följer du stegen som beskrivs nedan. Med hjälp av verktyget kanaler, som beskrivs i steg 5,6, ritar du en rak linje över varje signal och väljer kommandot Rita profil under menyn analysera. Upprepa det här steget för alla färger i fråga med samma ritade linje. Tryck på list -knappen för att anropa ett tomt värdes fönster och spara måtten för varje signal som en CSV-fil i rutan exempel på popup-fönster som visas efter varje profilerings steg. I ett statistik program skapar du ett diagram som ritar det gråa värdet för varje signal mot motsvarande plats (i μm) längs den ritade linjen. Bristande överlappning mellan signal profils områden indikerar i allmänhet bristen på samlokalisering.Anmärkning: Använd verktyget Rita profil på projicerade bilder för att undersöka samlokalisering av signaler. Detta är bara tillförlitligt om en sådan överlappning också observeras genom bilden z-stacken. För att övervaka det dynamiska beteendet hos fluorescerande proteiner över tid Använd verktyget multi Kymograph som finns under menyn analysera. Den resulterande bilden visar den fluorescerande signalen rörelse genom en serie av kondenserade ögonblicksbilder i varje bit av z-stacken, som representerar enskilda tidpunkter. Använd verktyget kanaler enligt beskrivningen i steg 5,6 för att isolera objektet av intresse i rätt kanal. Kontrollera att det valda objektet eller strukturen inte skiftar avsevärt genom z-stacken. Placera en rät linje eller rektangel över objektet, Välj verktyget multi Kymograph på menyn analysera och ange önskad bredd för linjen som överlägger objektet. Skapa bildpaneler som visar nukleär dynamik över ett visst tidsfönster med hjälp av verktyget kanaler enligt beskrivningen i steg 5,6 och genom att välja travar och skapa montage verktyg från bildmenyn. I fönstret gör montage popup-fönster anger du antalet kolumner och rader som önskas, anger en skalfaktor på 1,0, väljer den första och sista segment (tidsramar) och ändrar kantbredden till minst 5 innan du trycker på OK. Det är möjligt att välja vilka bilder i stapeln som ska visas genom att ändra steg för att passa önskad sekvens. För att skapa en film, ladda upp önskad hyperstack, Välj Spara som en AVI -fil från Arkiv -menyn, Välj ingen för komprimeringoch ange en bildrutehastighet på 2-8 fps. Välj kommandot gör montage när du plockar komposit i verktyget kanaler för att sammanfoga eller separera alla färger som innehåller bilden.Anmärkning: Två AVI-filer (film 1-2) tillhandahålls i detta protokoll. Använd dem i Fiji för att prova olika funktioner som belystes i steg 5. Om du vill visa en enda representativ cell använder du omforma och Rotera på bild -menyn och anger rotationsgrader. Negativa tal roterar objekt åt vänster, medan positiva värden roterar objekt åt höger. När cellen är i rätt orientering, rita en rektangel som omfattar hela cellen genom z-stacken eller under tidsramarna av intresse och välj Beskär från bild -menyn. Fortsätt som nämnts i steg 5,16 och 5.16.1 för att skapa en bild panel eller film. Lägg till ett skalningsfält på bildpanelen eller filmen genom att välja verktyg och skal fält från menyn analysera. I popup-fönstret Skalstapel anger du 5-15 för bredden i mikrometer för enskilda celler eller 100-250 för hela vyfält, väljer vit eller svart för färg och välj en lämplig plats för att placera skalstapeln. För filmer är det bra att Visa tidsförlopp under nukleära händelser. Om du vill visa tidsändring mellan bildrutor väljer du bild, klickar på staplar, använder verktyget Time Stamper , anger startramen i tidsserierna och väljer en lämplig plats för tidsvisningen.

Representative Results

Oavsett om levande cell avbildning används för Mitos eller meiosis, är det viktigt att anställa friska fission jästceller innan någon typ av observation. Kvaliteten på de resulterande uppgifterna är starkt beroende av utgångsmaterialet. Om celler svälta på grund av näringsämne begränsning eller överväxt, de kommer att Visa överskott vakuoler och minskad Cellstorlek (svält, figur 2A). För Mitos experiment, är det bäst att undvika att använda celler som visar cellulära stress (svält, figur 2A). Annars kommer experimentella resultat att vara inkonsekvent och oreproducerbara. För att kringgå denna begränsning, välja rätt Wild typkontroller och bekanta sig med de olika fenotyper av mutanter av intresse. Till exempel, mitotiska celler svalt för 12 h upphör att aktivt replikera DNA. Eftersom Tos4-GFP uttryck är associerat med G1/S-fas aktivitet22,23, logaritmiska celler som bär denna markör och en för nukleär Division (Sad1-dsred10) visar Pan-nukleära Tos4-GFP uttryck, Sad1-dsred Foci separation, och pågående septation (tyder på aktiv DNA-replikering och celldelning) (log, figur 2A), medan svalt celler visar ingen sådan aktivitet (svält, figur 2A). Detta resultat är förenligt med effekterna av näringsämne begränsning i fission jäst, vilket minskar transkription i G1, aktiverar G1/S cell Cycle Checkpoint, och främjar G0 Entry5. För meios experiment, celler måste växa till en hög densitet, men utan att nå den stationära fasen. Efteråt blandas celler av båda Mate-typer och inkuberas tillsammans i låg kväve. Underlåtenhet att para sig, vilket är fallet när cellerna inte är tillräckligt svalt av kväve, kommer att hindra dem från att komma in meios (ineffektiv, figur 2b). Robust flockulation av parning cellsuspensionen ökar cell-till-cell interaktion och därmed indikerar framgångsrik parning och effektiv meiotiska metafaserna induktion (effektiv, figur 2b). Agaros gel Pads och fysiska störningar av cellklumpar garanterar korrekt visualisering av enstaka celler eller ASCI (log, figur 2A; Effektiv, figur 2b). Pads måste ge en styv, men fuktig plattform på vilka celler är samtidigt fast på plats och skyddas från uttorkning. Dessutom måste kuddar vara tillräckligt tjocka för att tåla förändringar på grund av avdunstning och ge en planat yta som tillåter korrekt fokus under hela bilden förvärv (figur 1c). Täckslip rotation är nödvändigt att separera och sprida celler inom parning aggregat (figur 1f; Effektiv, figur 2b). Utan detta steg, några ASCI men många haploida celler observeras eftersom ASCI fastna i otillgängliga skikt av parning klumpar, medan haploida celler är fria att befolka alla tillgängliga enskiktslager fläckar (figur 2b). Även för mitotiska experiment, där cell klumpar är mindre problematiskt, täckslip rotation flyttar celler runt pad för att skapa ett enda cellskikt med tillräckligt utrymme mellan cellerna för att minska trängsel effekter och möjliggöra cellduplicering (log, figur 2A ). Atb2 är en α-tubulin komponent involverad i kromosom segregering i fission jäst Mitos och meios7,14. När Fluorescent taggade, detta cytoskelettet komponent möjliggör undersökning av de stadier som kännetecknar nukleär separation i Mitos. Under profas (0 ‘-20 ‘, figur 3a) sker nukleation av den mitotiska spindeln i den nukleära sidan av spindel stången (spbs), vilket framgår av Atb2-MRFP-fibrer som ställs mot en Htt1-GFP5 Pan-nukleär bakgrund. Under övergången till metafase-Anaphase (20 ‘-40 ‘, figur 3a) sträcker sig den mitotiska spindeln utåt och kärnan delas upp i två. När cellen går in i Telophasen (60 ‘-80 ‘, figur 3a), expanderar Atb2-MRFP bidirectionellt tills kromosomerna är helt åtskilda. Efter denna punkt, Atb2-mRFP fibrer omgruppera och spridas över cellytan för att återfå sin Interphase form i var och en av de resulterande dottercellerna. Cytokinesi (> 120 ‘, figur 3a) uppstår först efter en septum former och delar upp cellen genom fission. Efter förändringar i Hht1-GFP intensitet över en mitotisk cykel avslöjar tre viktiga steg i nukleär dynamik: metafas-Anaphase (medelhög intensitet, DNA Compaction: 20 ‘-40 ‘, figur 3a-B), Telophasen (låg INTENSITET, DNA separation: 60 ‘-80 ‘, Figur 3A-B) och G1 (ökande intensitet, DNA-dubblering: 100 ‘-120 ‘, figur 3a-b). På samma sätt, men med hjälp av celler som bara bär Hht1-mRFP och anställa multi-kymograph verktyg (se steg 5,15) i Fiji, är det möjligt att observera mitotisk uppdelning från metafor till Telophasen och utvärdera de nukleära rörelser inblandade under ordentlig syster Chromatid segregering (normal, figur 3c). MIS-segregering kymographs Visa signal aktivitet mellan de två viktigaste nukleära vägar, vilket indikerar möjlig mis-segregering på grund av kromosom fragmentering eller olämplig kromatid separation (släpar, figur 3c). Som tidigare nämnts, i spirande och fission jäst, är Tos4 transkriberas i G1 och funktioner under DNA-replikering i S-fas22,23. Detta kan observeras i en kymograph där Tos4-GFP uttryck ökar i kärnan efter Sad1-DsRed10 Foci flytta till motsatta riktningar (indikerar kärnkraft Division), men innan septum former, som föregår cytokinesi (39 ‘, figur 3D ; 36, figur 3e). Fasen av High Tos4-GFP aktivitet börjar vid slutet av M-G1/S övergång (45 ‘, figur 3e) och slutar i G2 (> 60’, figur 3e), direkt efter celldelningen. Medan kraftigt diffus under G1, Tos4-GFP signal intensitet ökar post Anaphasen och hela S-fas och co-Localizes med segregerade Sad1-DsRed Foci (45 ‘-60 ‘, figur 3e). Detta resultat avslöjar septation period i fission jäst när genomduplicering har börjat i dotterceller (G1/S), men cytokinesi har inte inträffat ännu. Hht1 är Histon H3 i fission jäst och är vanligen modifierad med fluorescerande taggar för att visualisera nukleärt DNA5,14. I Mitos, när celler övergår från metafas till telofas (20 ‘-120 ‘, figur 3a), observeras två urskiljbara förändringar av kärn massan. Den första förändringen innebär en sammandragning av kärnans storlek i metafas (20 ‘, figur 3a), medan den andra visar Nucleus delning under Anaphasen (40 ‘, figur 3a). Förutom att dela dessa förändringar med mitotiska celler uppvisar meiotiska celler nukleär svängning (dvs. häst-tailing) (-100 “till-50″, figur 4a-B) under homolog rekombination och ytterligare minskning av Nucleus storlek i slutet av Anaphasen II (70 ‘-90 ‘, Figur 4a). Hht1-mRFP används för att undersöka mis-segregering fenotyper såsom släpar eller fragmenterade kromosomer (släpar, figur 3c). Det är också anställd för att iaktta och beskriva den nukleära dynamiken i varje fas av meios (figur 4a-B). Kärn massan är stor och fluktuerar i storlek under mycket av häst-tailing (HT:-100 ‘ till-50 ‘, figur 4a-B)). Som celler ange metafas (MT:-40 ‘ till 0 ‘, figur 4a-B), kärnkraft storlek och svängning minskar, i överensstämmelse med ökad kondens aktivitet i detta skede. Uppkomsten av både Anaphasen I (MI: 10 ‘-60 ‘, figur 4a-b) och II (Mii: 70 ‘-90 ‘, figur 4a-b) är förknippad med ytterligare nukleär minskning och brist på nukleär rörelse, som korrelerar väl med de två nukleära divisioner som karakteriserar meios I och II (mi & Mii). Således är meios förknippad med nukleära storleks variationer när homolog kromosomer anpassa och kombinera och med nukleära storleks minskningar efter två omgångar av kromosom separation. Alleler som förändrar dessa nukleära dynamik är sannolikt förknippade med genom stabilitetsreglering i meios12,13. Rec8 är α-kleisin subenhet av meiotiska metafaserna sammanhållen i fission jäst. Det lastas på kromatin efter DNA-replikering (Mei-S) och håller syster kromatiderna bundna till varandra tills Anaphasen II. Efter metafase I, Rec8 avlägsnas från kromosom armar av separase och skyddas på centromer av Sgo1-PP2A. I slutet av homolog segregering, Rec8 elimineras också vid centromere, vilket möjliggör för syster kromatid separation (figur 5a)6,24. Rec8-GFP tillsammans med markörer för kromosom segregering såsom Sad1-DsRed eller Hht1-mRFP möjliggör visualisering av sammanhållning dynamik under meiosis. Rec8-GFP signal är Pan-nukleära under Mei-S (< <-90 ", figur 5a-B), profas I (-90″ till-50 ” , figur 5a-b), och metafas I (-40″ till 0 “, figur 5a-b). Denna observation avslöjar Association of Rec8-GFP längs kromosomer axlar som följer DNA-duplicering. Som celler in Anaphasen I (10 ‘, figur 5a-b), Rec8-GFP intensitet minskar i hela kärnan, men är fortfarande stark vid centromere, där den utgör ett fokus i varje kärn massa (20 ‘-70 ‘, figur 5a-b). Detta resultat är förenligt med Rec8-GFP nedbrytning längs kromosom armar men inte på centromere, som inträder efter homolog segregering. Innan Anaphasen II, Rec8 fokus försvinner, frigöra syster kromatider för separation i Mii (70 ‘-80’, figur 5a-B). Den Rec8-GFP markören är således användbar för att undersöka förhållanden som stör inrättandet, avlägsnande och övergripande stabiliteten i meiotiska metafaserna sammanhållning. Ihopkopplade med en markör för nukleär Division såsom Hht1-MRFP5,13, Rec8-GFP kan användas för att ta itu med frågor om hur sammanhållning timing och stabilitet före och under meios påverkar korrekt kromosom segregation12 ,13. Detta protokoll behandlar inte proteiner vars dynamik främst förekommer i cytosolen. Men tabell jag visar några cytosoliska proteiner som ofta används för att undersöka cytoskelettet och membran processer som är nödvändiga för endocytos, exocytos, och cytokinesi bland andra processer. Figur 1: beredning av agandydynor för levande cell avbildning. A) montering av glid preparat monterad med hjälp av en pipetthållare, labbtejp och Mikroskop glas. Placera diabilder vinkelräta mot varandra skapar en ficka där Agros pad former. Tillsats av Lab tejp bitar på sidorna justerar agaros pad bredd till de nödvändiga specifikationerna. (B) smält Agreste är låt svalna innan du sätter den på Mikroskop diabilder för att göra kuddar. I detta steg är det nödvändigt att fördela aguppstod volymen långsamt för att undvika att skapa luftbubblor. (C) den översta bilden är placerad på den dispenserade aguppstod plats för att bilda en cirkulär pad med en rak yta, även kanter, och inga synliga aguppkommit sprickor. (D) efter att ha satt ett prov av cellsuspensionen på aguppstod pad, Invertera Slide och placera ovanpå en luddfri pappershandduk för att ta bort extra flytande medium. (E) försiktigt placera en täckslip på aguppstod pad, se till att inte fälla några luftbubblor och kontrollera att fokus planet är platt för att undvika cell växling och fokusera frågor. (F) sakta och försiktigt, rotera täckslip medurs för att störa cell klumpar och för att generera en cell enskiktslager som gör det möjligt för cell expansion och bättre cell visualisering. (G,H) Använd en uppvärmd kolväteblandning för att försegla agandydynor och låt dem jämvikt till önskad temperatur före avbildning. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2: plockning av rätt celler. (A) översta paneler visar fission jästceller kvar att svälta i EMM plus kosttillskott för 72 h och bottenpanelen visar celler som genomgår logaritmisk tillväxt. I celler som är kvar att svälta, kan små cellmorfologier uppskattas. Den röda öppna pilen visar vakuolär granulat som är kännetecknande för svält. I logaritmiska kulturer, celler som visar långsträckta morfologier och septa (röd pil) finns i överflöd, vilket indikerar aktiv cyklingsdynamik. De högra panelerna visar celler som uttrycker Tos4-GFP och Sad1-DsRed signaler under svält och proliferation. Pan-Nuclear Tos4-GFP uttryck och Sad1-DsRed signaler att lokalisera till motsatta cell poler ses under aktiv proliferation, men inte i svält. (B) översta panelen visar celler av samma Mate-typ (h +) inte att para sig effektivt. Den röda öppna pilen visar ett par vakuolär celler som genomgår karyogamy. Detta är inte ovanligt i kulturer av h +-celler, där 10% av cellerna kan byta Mate-typ till h-. Nedre panelen visar ASCI följd av effektiv parning. Zygotic ASCI ta mångfaldig formerna inklusive den Zig-Zag (röd pil) och banan cell formerna (röd öppen pil). Skalstapel = 5 μm i längd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: mitotisk nukleär dynamik. A) Histone H3 (HHT1-GFP) och mikrotubule (Atb2-MRFP) proteiner följdes under en Mitos-cykel (120 min). Enskilda signaler för Hht1-GFP och Atb2-mRFP visas i svarta och vita paneler, medan BF merge visar dem i sina respektive färger. B) kvantifiering av Hht1-mgfp-intensitet över en mitotisk cykel. Förändringen i Hht1 nivåer är ett tecken på nukleär division under Mitosen och DNA-duplicering i G1. Ckymografer som uppvisar normal eller onormal segregering i Mitos där de resulterande nukleära vägarna antingen dela och behåller DNA-integritet eller avviker och främjar kromosom fragmentering eller för tidig kromatidseparation, respektive. (D,E) Kymograph och Mikrograf paneler som visar varaktigheten av M-till-G1/S avslöjas genom segregering av Sad1-dsred och uppkomsten av nukleära Tos4-GFP signaler. Notera de mellersta panelerna i E som genererades med hjälp av Fire lut i Fiji för att skapa en intensitetsgraderad termisk karta som underlättar identifieringen av fläckar med hög TOS4-GFP uttryck; i det här fallet lokaliserade till kärnan och överlappande Sad1-DsRed signaler, som förväntat. Skalstapel = 5 μm i längd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 4: Meiotic nukleär dynamik. (A) panel serie som visar rörelse, kompakaktion, och uppdelning av kärnan (Hht1-MRFP) under meiosis. Horse-tailing (HT) visar omfattande sida till sida nukleära svängningar följt av metafas (MT), där nukleära lateral förflyttning minskar och helt stannar precis före Anaphasen I. I meios i (mi), de viktigaste nukleära massan delas upp i två, medan i meios II (Mii) fyra kärnor genereras under processen av syster Chromatid separation. (B) kvantifiering av förändringen av kärnkraftsområdet (Hht1-MRFP) i ProPhase, METAFASE, mi & Mii. Kärnkraftsområdet är dynamiskt under HT-svängningar, blir kondenserat i MT, och ytterligare minskningar i storlek under MI & MII, där lite nukleär rörelse observeras (lång kärn-axel). Mätningen av den längsta kärn axeln (lång kärn axel) bygger på tanken att när en cirkel sträcker sig, upphör den att ha en konstant diameter och genererar minst två huvud axlar: lång och kort. När man övervakar förändringar i kärnan, så ger förändringar i antingen den långa eller korta axeln indikationer på nukleär rörelse. Skalstapel = 5 μm i längd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 5: Meiotic sammanhållning dynamik. (A) panel serie som visar hur Rec8-GFP signal förändring korrelerar med meiotiska metafaserna nukleär dynamik. Under HT och MT, Rec8-GFP signal är Pan-nukleära och följer nukleära rörelsen (Hht1-mFRP). I mi, Rec8-GFP avleder från kärnan, lämnar bara ett par Foci, vilket är förenligt med Rec8 avlägsnande från kromosom armar och etablering av Sgo1-PP2A skydd på centromere. När cellen närmar sig MII, Rec8-GFP Foci börjar försvinna och inte längre ses precis innan Anaphasen II. (B) kvantifiering av REC8-GFP-INTENSITET från HT till Mii. Liknar vad som ses i en, GFP signalen är hög genom HT och MT, avsevärt minskar under mi och helt försvinna i Mii. Detta mönstrar bekräftar sammanhållande dynamik på kromosom beväpnar och Centromeren, var den håller syster kromatiderna tjudrad tills ordnar till för att separeras i Mii. Skalstapel = 5 μm i längd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra. Protein Funktion Kommentarer Etiketten Referenser Hht1 Histone H3 involverad i DNA-förpackning Används för att undersöka kromosom dynamiken Hht1-mRFP 5, 14 Tos4 Tos4-funktionen sker under G1-fasen Anställd för att studera G1 timing Tos4-GFP 22, 23 Rad21/ Rec8 Sammanhållande subenheter involverade i att hålla systerkromatider tillsammans efter replikering Används för att analysera sammanhållnings stabiliteten under mitotiska (Rad21) och meiotiska segregering (Rec8) Rad21-GFP/Rec8-GFP 6, 24 Rad11 RPA-aktivitet sker under mitotisk DNA-reparation, meiotisk rekombination och slutar i metafas Används för att studera DNA-reparation i Mitos och rekombination dynamik i meios Rad11-YFP 5, 13 Rad52 Rad52 acivity sker under mitotisk DNA-reparation och meiotiska metafaserna rekombination Används för att studera DNA-reparation i Mitos och rekombination dynamik i meios Rad52-CFP 5, 13 Cnp1 Histone H3 cenp-en lokaliserar specifikt på centromer Används för att följa kromosom segregering dynamik i Mitos och meios Cnp1-mCherry 13 Swi6 Hp1 homologt protein som är involverat i heterokromatinbildning Används för att studera Heterokromatin mobilisering vid centromer och telomererna Swi6-GFP 13 Sad1 Sad1 är involverad i lokalisering av spindel stången kroppen till det nukleära kuvertet Används för att analysera kromosom segregering i Mitos och meios Sad1-mCherry 10 CYTOSOL & membran Atb2 Tubulin alpha 2 involverad i mikrotubuli cytoskelettet organisation Används för att undersöka kromosom segregering i Mitos och meios Atb2-mRFP 7, 14 Ync13 Exocytos och endocytos regulator inblandade i vesikelmedierad transport Används för att studera cell Väggs integritet under cytokinesi Ync13-Mecitrin 25 Rlc1 Myosin II subenhet involverad i kontraktila ring kontraktion Används för att utforska dynamiken i septum mognad och sammandragning RIc1-mCherry 25 Ccr1 NADPH-cytokrom P450-reduktas som är en del av ER-, plasma-och mitokrondrial yttre membran Används för att undersöka membranassocierad dynamik såsom endocytos, exocytos och cytokinesi Ccr1N-GFP 5 Gef1 Rho guanyl-nukleotid utbytes faktor som är involverad i upprättande och upprätthållande av cellpolaritet Används för att undersöka globala, mikrotubule-beroende cellpolaritet dynamik Gef1-mCherry-GBP 26 Fus1 Formin involverad i aktin fusion Focus församling under cytogami Används för att studera fusion dynamik i samband med fission jäst parning Fus1-sfGFP 27 Mnn9 Mannolsyltransferas subenhet involverad i protein N-bunden glykosylering i Golgi-apparaten Anställd för att studera Last mognad i Golgi som det fortskrider från CIS-Golgi till trans-Golgi Mnn9-mCherry 28 Num1 Kortikal förankring faktor för dynein inblandade i häst-tailing Används för att undersöka mitokonskberoende dynein förankring under nukleär svängning i meiotiska metafaserna profas i Num1-yEGFP 29 Tabell 1: markörer för nukleär och cytosolisk dynamik. Film 1: M-till-G1/S övergång som visar spindel Pole Body (SPB; Sad1-DsRed) separation före septation och ackumulering av Tos4-GFP kärn signal. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.) Film 2: slutförandet av den mitotiska cykeln som visar mikrotubuli (Atb2-MRFP) förlängning korrelera med Nuclear (Hht1-GFP) division. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ned.)

Discussion

Live-cell Imaging under Mitos och meios ger möjlighet att undersöka kärnkrafts dynamik utan att väsentligen störa fission jäst fysiologi vid datainsamling. Försiktighet måste dock iakttas för att säkerställa att cellerna växer till de önskade tätheter som är fria från miljömässiga påfrestningar. och för meiosis, att cellerna är avbildade under tiden för Terminal differentiering och inte för tidigt eller sent. Överskott cellulära trängsel, svält, och olämpliga tillväxt temperaturer är vanliga faktorer som bidrar till irreproducerbara observationer. Dessutom, Understam konstruktion, är det viktigt att testa att fluorescerande Taggar inte stör funktionerna av målgener eller inverkan övergripande cell kondition. Underlåtenhet att noggrant inspektera fenotyperna av stammar som transporterar fluorescerande markörer kan resultera i inkonsekventa och ojämförliga resultat över liknande genotyper.

Även Mikroskop aguppstod kuddar är enkla att montera, kan de också utgöra ett hinder för att få värdefulla bild data. Skapa aguppstod kuddar är så enkelt som att placera tre mikroskopbilder parallellt med varandra, dispensering smält aguppstod på mitten bilden, och sätta en bild som transverses toppen av andra bilder. Det är dock användbart att sätta ihop en Slide-Maker apparat som möjliggör bredd ändringar för att tillverka resistenta, situations-specifika aguppstod kuddar. En enkel Slide-Maker som ger pad bredd flexibilitet består av en plattform (pipettspetsar innehavaren eller bänken), två Mikroskop diabilder och Lab tejp fungerar som pad-bredd justeringsmekanism (figur 1a). Exakt pad tjocklek kommer att bero på bildbehandling tid krav, aguppstod varumärke, temperatur, täckslip tätningsmedel, avdunstning hastighet, etc. Därför är det viktigt att kalibrera avbildnings systemet före datainsamling för att öka den tekniska reproducerbarheten och för att förbättra kvaliteten på Live-cell Imaging^1,2,3. Pad yta, styvhet och sammansättning är väsentliga under långvarig bild förvärv. Aguppstod har låg bakgrund fluorescens, kan lätt formas, och vid lämplig koncentration, tål strukturell deformation på grund av avdunstning. Dessutom, att kombinera fission jästmedia med aguppstod inte äventyrar bildkvaliteten och möjliggör utökad observation av flera mitoser och meios cykler. Också, det är viktigt att undvika eventuella luftbubblor för Time-lapse mikroskopi. Inuti aguppstod kuddar och inom provet, luftfickor expandera över tiden, orsakar cell-Shifting och störa fokalplan. Förutsatt celler sprids effektivt isär av täckslip rotation, kan forskarna följa mitotiska processer över flera generationer och meiotiska händelser från kärnfusion till sporulation. Att göra och välja rätt pad för bild experiment tar tid att behärska, men en gång uppnåtts, kan bidra till mycket informativa Mikroskop observationer.

Som är fallet med andra metoder, är Live-cell mikroskopi inte fri från tekniska begränsningar. Användningen av Fluorescent-märkta proteiner introducerar gränser för experiment som begränsar omfattningen av vad som kan studeras. Foto-blekning och foto-toxicitet är problem som är typiska för långvarig bild förvärv. De kan motverkas genom att inte utsätta celler för korta våglängder för länge eller för ofta. För experiment med GFP, CFP, YFP, mRFP och DsRed, typiska fluorescerande proteiner som används i fission jäst Live-cell Imaging, är det vanligt att anställa 5-15% excitation ljus och 100-500 ms exponeringstid för rutinmässiga experiment. Dessa parametrar ändras dock enligt forskarens specifika experiment krav. Dessutom, z-stackar består av 9-13 sektioner med 0,5 μm mellanrum med hjälp av en 60x mål är tillräckligt för att lösa tjockleken på en fission jästcell. Dessutom är det viktigt att bekräfta att fluorescerande markörer inte stör korrekt reglering eller funktion av målproteiner eller genererar falska fenotyper. Det är därför tillrådligt att konstruera stammar som innehåller olika fluorescerande och affinitet taggar för samma målgen att bekräfta observationer på olika sätt. Dessutom är det forskarnas ansvar att se till att experimentella parametrar kan återges över experiment och att de insamlade uppgifterna är lämpade för efterföljande analys^1,3. Ingen teknik kan ersätta den beprövade praxis att noggrant validera experimentella system genom noggrann observation och noggrann undersökning av linearitet för att upptäcka fluorescerande signaler.

Slutligen är det viktigt att analysera mikroskopi data i format som inte ändrar RAW-bilder. Fiji ger utmärkta dokumentationsverktyg för att hålla koll på rådata mätningar och gör det möjligt för forskare att undersöka olika cell parametrar i en enda session. Dessa funktioner, liksom dess rikedom av online-tutorials och omfattande litteratur täckning, göra Fiji ett viktigt verktyg för att mäta, analysera och presentera levande cell avbildning data som beskriver den nukleära dynamiken i fission jäst i Mitos och meiosis.

Materials

60x Plan Apochromat objective lens	Olympus	AMEP4694
Adenine	Sigma	A-8751
Agar	7558B	IB4917-10 kg
Agarose	Sigma	A9539-500g
Belly Dancer rotator	Stovall	US Patent #4.702.610
Biotin	Sigma	B-4501
Boric acid	Sigma	B-6768-5kg
CaCl2·2H20,	Sigma	C3306-500G
Citric acid	Sigma	C-0759
Convolve 3D software plug-in	OptiNav, Inc.	n/a
CoolSnap HQ CCD camera	Roper	n/a
Cover slip	VWR	16004-302
CuSO4·5H20,	END	CX-2185-1
DeltaVision deconvolution fluorescence microscope	GE Healthcare/Applied Precision	n/a
Diffraction PSF 3D software plug-in	OptiNav, Inc.	n/a
Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen	Sunrise	2023;1kg
FeCl2·6H2O	END	FX9259-04
Glucose	Sigma	G-7021
Heat plate	Barnstead	Thermo Lyne
Histidine	Sigma	H8125-100g
Huygens deconvolution software	SVI	n/a
Imaris deconvolution software	Bitplane	n/a
Incubator	Shell lab	#3015
Inositol	Sigma	I-5125
Iterative Deconvolve 3D software plug-in	OptiNav, Inc.	n/a
KCl	Mallinckvadt	6858-04
Lanolin	Sigma	L7387-1kg
Leucine	Sigma	L8912-100g
Lysine	Sigma	L5626-500g
Malt extract (ME)	MP	4103-032
MgCl2·6H20	AMRESCO	0288-500G
MetaMorph	Molecular Devices	n/a
Microscope slides	VWR	16004-422
MnSO4,	Mallinckvadt	6192-02
Molybdic acid	Sigma	M-0878
Na2S04	Mallinckvadt	8024-03
Nicotinic acid,	Sigma	N-4126
Pantothenic acid	Sigma	P-5161
Paraffin wax	Fisher	s80119WX
Pombe glutamate medium (PMG)	Sunrise	2060-250
softWorx v3.3 image processing software	GE Healthcare	n/a
Sporulation Medium powder	Sunrise	1821-500
Temperature controlled centrifuge	Beckman	Allwgra 6KR xentrifuge
Uracil	AMRESCO	0847-500g
Vaseline	Equaline	F79658
yeast extract	EMD	1.03753.0500
Yeast extract plus supplements (YES)	Sunrise	2011-1kg
ZnSO4·7H2O	J.T.Baker	4382-04