Her præsenterer vi Live-Cell Imaging, som er en ikke-giftige mikroskopi metode, der giver forskerne mulighed for at studere protein adfærd og nuklear dynamik i levende fission gærceller under mitose og meiosis.
Live-Cell Imaging er en mikroskopi teknik, der anvendes til at undersøge celle-og protein dynamik i levende celler. Denne Imaging metode er ikke giftigt, generelt ikke forstyrrer celle fysiologi, og kræver minimal eksperimentel håndtering. De lave niveauer af teknisk interferens gør det muligt for forskerne at studere celler på tværs af flere cyklusser af mitose og observere meiose fra start til. Ved hjælp af fluorescerende Tags såsom grøn fluorescerende protein (GFP) og rødt fluorescerende protein (RFP), forskere kan analysere forskellige faktorer, hvis funktioner er vigtige for processer som transkriptionen, DNA-replikering, samhørighed, og adskillelse. Kombineret med dataanalyse ved hjælp af Fiji (en gratis, optimeret ImageJ version), Live-Cell Imaging tilbyder forskellige måder at vurdere protein bevægelse, lokalisering, stabilitet, og timing, samt nuklear dynamik og kromosom adskillelse. Men som det er tilfældet med andre mikroskopi metoder, er levende celle billeddannelse begrænset af de iboende egenskaber af lys, som sætter en grænse for opløsningen magt ved høje forstørrelser, og er også følsom over for foto blegning eller fototoksicitet ved høj bølgelængde Frekvenser. Men, med en vis omhu, efterforskere kan omgå disse fysiske begrænsninger ved omhyggeligt at vælge de rigtige betingelser, stammer, og fluorescerende markører for at muliggøre en passende visualisering af mitotiske og meiotiske hændelser.
Levende celle mikroskopi giver forskerne mulighed for at undersøge nuklear dynamik uden at dræbe fissions gærceller og eliminerer behovet for dødbringende fikater og pletter. Det er muligt at observere stabilitet, bevægelse, lokalisering og timing af fluorescently mærkede proteiner, der er involveret i vigtige begivenheder såsom kromosom replikation, rekombination, og adskillelse, ud over membranen og cytoskelet Bevægelser. Ved at opretholde cellelevedygtighed og ikke-giftige signaldetektering, der er minimal fysiologisk indtrængen. Når det udføres korrekt, denne mikroskopi metode kan reducere forstyrrende virkninger, der opstår fra den udvidede tekniske håndtering eller fra falsk kemisk reaktivitet. Endvidere, under et eksperiment, forskere kan gøre relevante observationer af fission gær ernæringsmæssige og stress tilstande, proliferativ effektivitet, og apoptotiske status, der indikerer uhensigtsmæssige Imaging parametre eller unormal celle fysiologi1 ,2,3.
Mitose og meiose er karakteriseret ved nuklear og cellulær division. I meiosis, i modsætning til mitose, er genetisk indhold halveret som stamceller giver anledning til datter celler4. Da Live-Cell Imaging giver en tidsmæssig dimension ud over det rumlige forhold, kan et stort antal celler undersøges i realtid. Live-Cell mikroskopi har gjort det muligt for forskerne at undersøge dynamikken i nuklear division ved hjælp af fluorescerende Tags for histoner5, sammenhængende under enheder6, mikrotubuli7, centromeres8, kinetochores9, komponenter af spindel pole Body (SPB)10, og dem af kromosom passager Complex (CPC)11. Uden for kromosom segregation apparat, Live-Cell Imaging har også fanget opførsel af proteiner nødvendigt, men ikke direkte involveret i kromosom adskillelse. Funktionen af disse proteiner har vist sig at påvirke replikation, kromosom rekombination, nuklear bevægelse, og kromosom fastgørelse til mikrotubuli12,13,14. Disse observationer har bidraget til en bedre forståelse af cellulære hændelser, hvis funktionelle komponenter ikke var modtagelige for biokemiske eller genetiske undersøgelser. Med nye fremskridt inden for mikroskopi teknologi, begrænsninger såsom dårlig opløsning, foto blegning, fototoksicitet, og fokus stabilitet vil mindske, og dermed lette bedre real-time observationer af mitotisk og meiotisk nuklear dynamik1, 2,3. Meiosis er særlig udfordrende, da det er en terminaldifferentierings vej, der kræver nøje opmærksomhed på timing.
Formålet med denne protokol er at fremlægge en forholdsvis enkel metode til undersøgelse af realtids fission af fissions gær i mitose og meiosis. For at opnå dette, er det nødvendigt at bruge celler, der ikke har været udsat for miljømæssig stress, forberede agrose Pads, der kan modstå langvarig billeddannelse, og montere celler på tætheder, som letter visualisering af enkelt celle dynamik. Desuden gør denne protokol brug af celler, der bærer fluorescently mærkede proteiner, som fungerer som nyttige markører for nuklear kinetik (Hht1-mRFP eller Hht1-GFP), kromosom adskillelse (Sad1-DsRed), cytoskelet dynamik (Atb2-mRFP), transkriptional aktivering i G1/S (Tos4-gfp) og samhørigheds stabilitet i meiose (Rec8-gfp). Denne metode introducerer også yderligere nukleare og cytosolisk markører (tabel I), der kan bruges i forskellige kombinationer til at løse spørgsmål om specifikke cellulære processer. Endvidere, grundlæggende Fiji værktøjer er featured for at hjælpe forskere behandle Live-celle billeder og analysere forskellige typer af data. Styrken af denne tilgang stammer fra brugen af real-time observationer af protein dynamik, timing, og stabilitet til at beskrive processer, der er integreret for korrekt udførelse af mitose og meiosis.
Live-Cell Imaging under mitose og meiose giver mulighed for at undersøge nuklear dynamik uden væsentligt at forstyrre fission gær fysiologi under dataindsamling. Der skal dog udvises forsigtighed for at sikre, at cellerne vokser til de ønskede tætheder uden miljømæssige belastninger. og for meiosis, at cellerne er afbildet i tidspunktet for den terminale differentiering og ikke for tidligt eller sent. Overskydende cellulære fortrængning, sult og uhensigtsmæssige vækst temperaturer er almindelige faktorer, der bidrager til irreproducerbare observationer. Hertil kommer, under stammen byggeri, er det afgørende at teste, at fluorescerende Tags ikke forstyrrer funktionerne af Target gener eller indvirkning samlede celle egnethed. Manglende nøje inspektion af fænotyper af stammer, der transporterer fluorescerende markører kan resultere i inkonsekvente og uforlignelige resultater på tværs af lignende genotyper.
Selvom mikroskop agopstået puder er enkle at samle, kan de også udgøre en forhindring i at få værdifulde billeddannelse data. Oprettelse af agrose Pads er så simpelt som at placere tre mikroskop glider parallelt med hinanden, dispensering smeltet agopstået på den midterste slide, og sætte et dias, der krydser toppen af de andre slides. Det er imidlertid nyttigt at samle et slide-Maker apparat, der giver mulighed for bredde modifikationer til fremstilling af resistente, situationsspecifikke agrose Pads. En simpel slide-Maker, der giver pad bredde fleksibilitet består af en platform (pipettespidser indehaveren eller bænken), to mikroskop slides, og lab tape fungerer som pad-bredde justeringsmekanismen (figur 1a). Nøjagtig pad tykkelse vil afhænge af Imaging tid krav, agopstået mærke, temperatur, dækglas fugemasse, fordampning sats, etc. Det er derfor vigtigt at kalibrere billed systemet før dataindsamlingen for at øge den tekniske reproducerbarhed og forbedre kvaliteten af levende celle billeder1,2,3. Pad overflade, stivhed, og sammensætning er afgørende ved længerevarende billed erhvervelse. Agopstået har lav baggrunds fluorescens, kan let formes, og i den relevante koncentration, modstår strukturel deformation på grund af fordampning. Desuden, kombinere fission gær medier med agopstået ikke kompromitterer billedkvaliteten og giver mulighed for udvidet observation af flere mitoser og meiose cyklusser. Det er også vigtigt at undgå luftbobler for time-lapse mikroskopi. Indvendige agrose Pads og inden i prøven, luftlommer ekspandere over tid, forårsager celle-skiftende og forstyrre brændfly. Forudsat celler effektivt spredes fra hinanden ved dækglas rotation, kan forskerne følge mitotiske processer på tværs af flere generationer og meiotiske begivenheder fra nuklear fusion til sporulation. At gøre og vælge den rigtige pad til billeddannelse eksperimenter tager tid at mestre, men når det er opnået, kan bidrage til meget informative mikroskop observationer.
Som det er tilfældet med andre metoder, er levende celle mikroskopi ikke fri for tekniske begrænsninger. Brugen af fluorescently-mærkede proteiner introducerer grænser til eksperimenter, der begrænser omfanget af, hvad der kan undersøgt. Foto-blegning og foto-toksicitet er problemer typisk for langvarig billed erhvervelse. De kan modvirkes ved ikke at udsætte celler for korte bølgelængder for længe eller for ofte. For eksperimenter, der involverer GFP, CFP, YFP, mRFP, og DsRed, typiske fluorescerende proteiner anvendes i fission gær Live-Cell Imaging, det er almindeligt at ansætte 5-15% excitation lys og 100-500 MS eksponeringstid for rutine eksperimenter. Disse parametre ændrer sig dog i henhold til forskeres specifikke eksperiment krav. Desuden z-stakke består af 9-13 sektioner med 0,5 μm afstand ved hjælp af en 60x mål er nok til at løse tykkelsen af en fission gær celle. Desuden er det vigtigt at bekræfte, at fluorescerende markører ikke forstyrrer korrekt regulering eller funktion af målproteiner eller genererer spuriøse fænotyper. Det er derfor tilrådeligt at konstruere stammer, der indeholder forskellige fluorescerende og affinitets Tags for det samme målgen til at underbygge observationer med forskellige midler. Det er endvidere forskernes ansvar at sikre, at eksperimentelle parametre kan gengives på tværs af eksperimenter, og at de indsamlede data er egnede til downstream-analyse1,3. Ingen teknologi kan erstatte den tidstestede praksis med omhyggeligt at validere eksperimentelle systemer ved omhyggelig observation og grundig undersøgelse af linearitet i påvisning fluorescerende signaler.
Endelig er det afgørende at analysere mikroskopi data i formater, der ikke ændrer RAW-billeder. Fiji giver fremragende dokumentationsværktøjer til at holde styr på rå data målinger og giver forskerne mulighed for at undersøge forskellige celle parametre i en enkelt session. Disse funktioner, samt dens rigdom af online tutorials og omfattende litteratur dækning, gøre Fiji et vigtigt redskab til at måle, analysere og præsentere levende celle billeddannelse data, der beskriver den nukleare dynamik af fissions gær i mitose og meiosis.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Natalia La Fourcade og mon LaFerte for at gøre forberedelsen af dette manuskript til en mere fornøjelig bestræbelse. Takket være medlemmer af Forsburg Lab, der bidrog til færdiggørelsen af dette arbejde med deres indsigt, eksperiment ideer, og moralsk støtte. Dette projekt blev støttet af NIGMS R35 GM118109 til SLF.
60x Plan Apochromat objective lens | Olympus | AMEP4694 | |
Adenine | Sigma | A-8751 | |
Agar | 7558B | IB4917-10 kg | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Belly Dancer rotator | Stovall | US Patent #4.702.610 | |
Biotin | Sigma | B-4501 | |
Boric acid | Sigma | B-6768-5kg | |
CaCl2·2H20, | Sigma | C3306-500G | |
Citric acid | Sigma | C-0759 | |
Convolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
CoolSnap HQ CCD camera | Roper | n/a | |
Cover slip | VWR | 16004-302 | |
CuSO4·5H20, | END | CX-2185-1 | |
DeltaVision deconvolution fluorescence microscope | GE Healthcare/Applied Precision | n/a | |
Diffraction PSF 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
Edinburgh minimal medium (EMM) Notrogen | Sunrise | 2023;1kg | |
FeCl2·6H2O | END | FX9259-04 | |
Glucose | Sigma | G-7021 | |
Heat plate | Barnstead | Thermo Lyne | |
Histidine | Sigma | H8125-100g | |
Huygens deconvolution software | SVI | n/a | |
Imaris deconvolution software | Bitplane | n/a | |
Incubator | Shell lab | #3015 | |
Inositol | Sigma | I-5125 | |
Iterative Deconvolve 3D software plug-in | OptiNav, Inc. | n/a | |
KCl | Mallinckvadt | 6858-04 | |
Lanolin | Sigma | L7387-1kg | |
Leucine | Sigma | L8912-100g | |
Lysine | Sigma | L5626-500g | |
Malt extract (ME) | MP | 4103-032 | |
MgCl2·6H20 | AMRESCO | 0288-500G | |
MetaMorph | Molecular Devices | n/a | |
Microscope slides | VWR | 16004-422 | |
MnSO4, | Mallinckvadt | 6192-02 | |
Molybdic acid | Sigma | M-0878 | |
Na2S04 | Mallinckvadt | 8024-03 | |
Nicotinic acid, | Sigma | N-4126 | |
Pantothenic acid | Sigma | P-5161 | |
Paraffin wax | Fisher | s80119WX | |
Pombe glutamate medium (PMG) | Sunrise | 2060-250 | |
softWorx v3.3 image processing software | GE Healthcare | n/a | |
Sporulation Medium powder | Sunrise | 1821-500 | |
Temperature controlled centrifuge | Beckman | Allwgra 6KR xentrifuge | |
Uracil | AMRESCO | 0847-500g | |
Vaseline | Equaline | F79658 | |
yeast extract | EMD | 1.03753.0500 | |
Yeast extract plus supplements (YES) | Sunrise | 2011-1kg | |
ZnSO4·7H2O | J.T.Baker | 4382-04 |