यहाँ, हम एक फीडर में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से ठीक hemogenic endothelium फार्म के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत- और विदेशी मुक्त हालत. इस विधि रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग में व्यापक अनुप्रयोगों होगा.
मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं (PSCs) से कार्यात्मक hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) को प्राप्त करने के लिए hematological और घातक विकारों के इलाज के लिए autologous प्रत्यारोपण के लिए एक मायावी लक्ष्य किया गया है. हेमोजेनिक एंडोथेलियम (एचई) ट्रांसक्रिप्शन कारकों द्वारा कार्यात्मक एचएसपीसी का उत्पादन करने के लिए या एक मजबूत तरीके से लिम्फोसाइटों को प्रेरित करने के लिए एक अनुकूल मंच है। हालांकि, एचई प्राप्त करने के लिए वर्तमान तरीके या तो महंगा है या उपज में चर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में, हमने फीडर और विदेशी-मुक्त परिभाषित स्थिति में 4 दिनों के भीतर महामहिम को प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी और सटीक विधि स्थापित की। परिणामी हे एक एन्डोथेलियल-टू-हेमेटोपोइटिक संक्रमण करते थे और सीडी 34+सीडी 45+ क्लोनोजेनिक हेमेटोपोएटिक जनक उत्पन्न हुए। कार्यात्मक HSPCs पैदा करने के लिए हमारे मंच की क्षमता क्षमता रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग में व्यापक अनुप्रयोगों होगा.
हेमेटोलॉजिकल और इम्यूनोलॉजिकल विकारों के लिए नई चिकित्सकीय के विकास रोग मॉडलिंग के लिए मजबूत प्लेटफार्मों की कमी से बाधित किया गया है और autologous hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) रोगी से व्युत्पन्न के साथ उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग pluripotent स्टेम सेल (PSCs). प्रेरित (i) पीएससी प्रौद्योगिकी की सफलता रोगियों की कोशिकाओं से मॉडल रोगों के लिए वादा रखती है, लेकिन रोगी iPSCs से कार्यात्मक एचएससी की स्थापना मायावी है. मानव पीएससी से एचएससी प्राप्त करने के लिए भ्रूणीय पैटर्न और ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों को उचित रूप से शामिल किया जाता है , यह कुंजी1,2,3,4,5,6, 7,8. हेमेटोपोइटिक विकास में हाल ही में हुई प्रगति ने एचएससी विकास9में हेमोजेनिक एंडोथेलियम (एचई) की भूमिका का प्रदर्शन किया है। महामहिम को पीएससी से प्रेरित किया जा सकता है और यह डाउनस्ट्रीम हस्तक्षेप के लिए अनुकूल है जैसे जीन अंतरण10,11,12,13. एक मंच के रूप में महामहिम का उपयोग करना, 5 प्रतिलेखन कारकों का संयोजन(ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) सफलतापूर्वक कार्यात्मक HSS प्रेरित है कि लंबी अवधि engraft और कई वंशों में अंतर14. तथापि, पीएससी से एचई की चर और अक्षम पीढ़ी ने नैदानिक उपयोग के लिए ऑफ-द-शेल्फ उत्पादन और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर प्रेरण के साथ-साथ कोशिकाओं के व्यवस्थित हेरफेर और विश्लेषण को बाधित किया है।
यहाँ, हम एक फीडर और विदेशी मुक्त परिभाषित शर्त के साथ 4 दिनों में महामहिम प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी और सटीक विधि का वर्णन. इस विधि में, इमेरिक्स-511 पर गोलभड गठन और सहज पुन: सपाट पीएससी कालोनियों का एक सुसंगत घनत्व सुनिश्चित करता है, जो एचई कोशिकाओं के कुशल प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है।
हमारे फीडर- और विदेशी मुक्त परिभाषित प्रेरण विधि एक स्केलेबल तरीके से एचई कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए एक सटीक और लागत प्रभावी मंच प्रदान करता है। पारंपरिक प्रोटोकॉल10,11, 12,13,14 में हेमोजेनिक एंडोथेलियम के वफादार गठन पीएससी कॉलोनी घनत्व और आकार के सटीक नियंत्रण की कमी के कारण बाधित किया गया है , जो मॉर्फोजेन/साइटोकीन आधारित निर्देशित विभेदन की दक्षता को प्रभावित करता है। हम पारंपरिक प्रोटोकॉल से प्रत्येक स्वतंत्र बैच में हेमोजेनिक endothelium प्रेरण की असंगति का अनुभव किया था. नए प्रोटोकॉल पीएससी कॉलोनी घनत्व और आकार के तंग विनियमन सक्षम बनाता है, इस प्रकार हेमोजेनिक एंडोथेलियम प्रेरण की असंगति पर काबू पा लिया।
हमने स्फीरोइड के वर्दीधारी गठन का उपयोग किया और बाद में कुल 4 दिनों में एचई बनाने के लिए एक फीडर- और विदेशी मुक्त परिभाषित स्थिति से अवगत कराया। हम तीन स्वतंत्र सेल लाइनों का उपयोग कर की पुष्टि की है कि गोलभय गठन एचई कोशिकाओं के लगातार गठन का आश्वासन दिया. एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, 409B2 सेल लाइनों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के आधार पर 12.7%-23.6% CD34+ सेल दक्षता मिले. पीएससी स्फीरोइड को टाइल करने के लिए महत्वपूर्ण कारक LM511-E8 है। हम इस अन्य मैट्रिक्स के साथ प्रतिस्थापन की सिफारिश नहीं है, ऐसे Matrigel या हमारे अनुभवों में पूर्ण लंबाई laminin उत्पादों के रूप में. हमने अनुभव किया कि मध्यप्रर्मल organoids आसानी से Matrigel से अलग कर रहे थे और भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान खो दिया है. और न ही Matrigel या पूर्ण लंबाई laminin पूर्व कोटिंग के बिना कोशिकाओं लंगर नहीं है.
इस प्रोटोकॉल की संभावित सीमा यह है कि हम पीएससी रखरखाव के माध्यम पर निर्भर करते हैं ताकि पीएससी बनाए रखी जा सके। हम ऐसे StemFit के रूप में अन्य मीडिया का परीक्षण किया है, लेकिन हम hemogenic प्रेरण समझौता किया. शायद कोशिकाओं को हमारे कम समय (4 दिन) प्रेरण प्रोटोकॉल में pluripotent राज्य से बाहर निकलने के लिए प्रतिरोधी थे. यदि कोई अन्य मीडिया में पीएससी रखता है, तो हम पीएससी रखरखाव माध्यम में कोशिकाओं को अनुकूलित करने की सलाह देते हैं और भेदभाव से पहले कुछ मार्ग संचालित करते हैं। यह मंच कोशिकाओं के व्यवस्थित हेरफेर और विश्लेषण की अनुमति देगा, और संभावित नैदानिक उपयोग के लिए ऑफ-द-शेल्फ उत्पादन और बड़े पैमाने पर हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को शामिल किया जाएगा। इस प्रणाली का एक दीर्घकालिक लक्ष्य जिम्मेदार सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच और दवा स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए मानवीय माउस मॉडल में इम्यूनोडेफिशियेंसी रोगों का मॉडल है।
The authors have nothing to disclose.
हम उनकी तकनीकी सहायता के लिए Alina ली और Seiko Benno के आभारी हैं. हम कागज के संपादन के लिए प्रशासनिक सहायता और डा पीटर कारागियान्स को प्रदान करने के लिए सुश्री हारुमी वाटानाबे को भी धन्यवाद देना चाहेंगे। यह काम चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी से अपक्षयी चिकित्सा के एहसास के लिए अनुसंधान केंद्र नेटवर्क के आई पी एस सेल अनुसंधान के लिए कोर सेंटर द्वारा समर्थित किया गया था (AMED) [M.K.S.], Intractable रोग अनुसंधान के लिए कार्यक्रम उपयोग. AMED के रोग-विशिष्ट आई पी एस कोशिकाओं (17935423) [M.K.S.] और जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST) के नवाचार कार्यक्रम के लिए केंद्र [आर.ओ. और एम.के.एस.].
0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5M EDTA |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B |
anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |