Här presenterar vi ett protokoll för att exakt bilda hemogent endotel från humana pluripotenta stamceller i ett Matnings-och xenofritt tillstånd. Denna metod kommer att ha breda tillämpningar inom sjukdoms modellering och screening för terapeutiska föreningar.
Att härleda funktionell hematopoetisk stam och stamceller (HSPCs) från humana pluripotenta stamceller (PSC) har varit ett svårfångade mål för autologa transplantationer för att behandla hematologiska och maligna sjukdomar. Hemogent endotel (HE) är en mottagbar plattform för att producera funktionella HSPCs genom transkriptionsfaktorer eller för att inducera lymfocyter på ett robust sätt. Men nuvarande metoder för att härleda han är antingen kostsamma eller varierande i avkastning. I detta protokoll har vi fastställt en kostnads effektiv och exakt metod för att härleda HE inom 4 dagar i en feeder-och Xeno-fri definierade villkor. Den resulterande han genomgick en endotelial-till-hematopoetisk över gång och producerade CD34+CD45+ klonogena hematopoetiska progenitorer. Den potentiella kapaciteten hos vår plattform för att generera funktionella HSPCs kommer att ha breda tillämpningar inom sjukdoms modellering och screening för terapeutiska föreningar.
Utvecklingen av nya terapier för hematologiska och immunologiska sjukdomar har hämmats av avsaknaden av robusta plattformar för sjukdoms modellering och hög genom strömning drog screening med autologa hematopoetiska stamceller (HSCs) som härrör från patientens de pluripotenta stamcellerna (PSC). Genombrottet av inducerad (i) PSC-teknik håller löftet att modellera sjukdomar från patienternas celler, men inrättandet av funktionella HSCs från patientens iPSCs har varit svårfångade. För att härleda hscs från mänskliga PSCs, är korrekt induktion av embryonala mönster och transkriptionella program nyckel1,2,3,4,5,6, 7,8. De senaste framstegen i hematopoetisk utveckling har visat rollen av hemogent endotel (HE) i HSC utveckling9. Han kan induceras från PSCs och är mottaglig för nedströms intervention såsom gen överföring10,11,12,13. Med hjälp av he som plattform, kombinationen av 5 transkriptionsfaktorer (ERG, HOXA5, HOXA9, lcor, RUNX1) framgångs rikt inducerade funktionella hscs som implantera långsiktiga och differentiera till flera linjer14. Men, varierande och ineffektiv generering av HE från PSC har hindrat systematisk manipulation och analys av celler tillsammans med off-the-shelf produktion och storskalig induktion av hematopoetiska celler för klinisk användning.
Här beskriver vi en kostnads effektiv och exakt metod för att härleda HE i 4 dagar med ett Matnings-och xenofritt definierat tillstånd. I denna metod, sfäroiden bildning och spontan åter tillplattning på iMarix-511 säkerställer en konsekvent densitet av PSC-kolonier, vilket är avgörande för en effektiv induktion av HE-celler.
Vår matar-och xenofria definierade induktions metod erbjuder en exakt och kostnads effektiv plattform för att inducera HE-celler på ett skalbart sätt. Den trogna bildandet av hemogena endotelet i konventionella protokoll10,11,12,13,14 har hämmats av brist på exakt kontroll av PSC kolonidensitet och storlek, som påverkar effektiviteten hos morfogen/cytokin-baserad riktad differentiering. Vi hade upplevt inkonsekvens av hemogena endotelium induktion i varje oberoende parti från konventionella protokoll. Det nya protokollet möjliggör en stram reglering av PSC kolonidensitet och storlek, därmed övervinner inkonsekvensen av hemogena endotelium induktion.
Vi utnyttjade den uniformerade bildandet av sfäroider och därefter förmedlas en feeder-och Xeno-fri definierade villkor för att bilda HE i totalt 4 dagar. Vi bekräftade med hjälp av tre oberoende cellinjer att sfäroiden bildandet försäkrar konsekvent bildandet av HE celler. Som ett representativt resultat gav 409B2 cellinjerna 12,7%-23,6% CD34+ cell effektivitet baserat på tre oberoende experiment. Den kritiska faktorn för att kakel PSC sfäroider är LM511-E8. Vi rekommenderar inte att ersätta detta med andra matriser, såsom Matrigel eller ful längds laminin produkter i våra erfarenheter. Vi upplevde att mesodermala organoider var lätt lossnat från Matrigel och förlorade under differentierings processen. Och varken Matrigel eller ful längds laminin inte ankare celler utan pre-beläggning.
Den potentiella begränsningen av detta protokoll är att vi är beroende av PSC-underhållsmediet för att upprätthålla gemensamma kontakt punkter. Vi har testat andra medier som StemFit, men vi har kompromissat med hemogen induktion. Förmodligen celler var resistenta mot utträde ur pluripotenta tillstånd i vår korta tid (4 dagar) induktions protokoll. Om man upprätthåller gemensamma kontakt punkter i andra medier, rekommenderar vi att anpassa cellerna i PSC underhålls medium och genomföra ett par passager före differentiering. Denna plattform kommer att möjliggöra systematisk manipulation och analys av celler, och off-the-shelf produktion och storskalig induktion av hematopoetiska celler för potentiell klinisk användning. Ett långsiktigt mål för detta system är att modellera immun brist sjukdomar i humaniserad mus modeller för att undersöka de ansvariga cellulära och molekyl ära mekanismer och genomföra drog visningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma för Alina Li och Seiko Benno för deras tekniska assistans. Vi vill också tacka MS Harumi Watanabe för att ge administrativt stöd och Dr Peter Karagiannis för att redigera papperet. Detta arbete stöddes av Core Center för iPS cell Research av Research Center nätverk för förverkligande av regenerativ medicin från Japan Agency för medicinsk forskning och utveckling (AMED) [M.K.S.], programmet för Svårsmittat sjukdomar forskning Använda. Sjukdomsspecifika iPS-celler från AMED (17935423) [M.K.S.] och Center for innovation-programmet för Japans vetenskaps-och teknik byrå (JST) [R.O. och M.K.S.].
0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5M EDTA |
40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/ Streptomycin/Amphotericin B |
anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
Stemline Ⅱ Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |