マウス心臓分野特異的心臓前駆細胞のインビトロ生成
Summary
この方法の目的は、前駆細胞の仕様および機能性を研究するためにインビトロで心臓界特異的心臓前駆細胞を生成し、心臓病モデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成することである。
Abstract
多能性幹細胞は、心臓の発達や病気を理解し、再生医療に大きな可能性を提供します。近年の発達心理学の進歩は多能性幹細胞から心臓細胞を生成することにつながっているが、第1および第2の心臓場(FHFおよびSHF)の2つの心臓界が多能性幹細胞系に誘導されているかどうかは不明である。この問題に対処するために、心臓界特異的心臓前駆細胞のインビトロ仕様および単離のためのプロトコルを生成した。Hcn4-GFPとTbx1-Creを運ぶ胚性幹細胞ラインを使用しました。FHFとSHFのRosa-RFPレポーターは、それぞれ、細胞膜タンパク質Cxcr4の生細胞免疫染色、SHFマーカーである。このアプローチにより、生体内の機能特性とトランスクリプトームを要約する前駆細胞を生成した。我々のプロトコルは、2つの心臓分野の早期の仕様と分離を研究し、心臓病のモデリングのためのチャンバー特異的心臓細胞を生成するために利用することができる。これはインビトロオルガノイド系であるため、正確な解剖学的情報を提供しない場合があります。しかし、このシステムは、胃の段階胚の貧弱なアクセシビリティを克服し、ハイスループットスクリーンのためにアップスケールすることができます。
Introduction
多能性幹細胞(PSC)の使用は、疾患モデリングおよび薬物療法のための患者特異的筋細胞を用いた心臓再生および個別化医療の分野に革命を起こした1,2,3,4.さらに最近では、心房対心室およびペースメーカー様PSC由来心筋細胞の生成のためのインビトロプロトコルが5、6に開発されている。しかし、心臓の発達を研究し、その後心室特異的な心臓細胞を生成するために、心形成をインビトロで再現できるかどうかは、まだ不明である。
初期胚発生の間、BMP4、WntsおよびアクティビンAなどの分泌された形態素の影響下にある中皮細胞は原始的な筋7を形成する。Mesp1の発現によってマークされた心臓中皮細胞は、心三日月を形成し、次いで原始的な心臓管7、8を形成するために前部および後者に移行する。この細胞の移動群は、心臓前駆細胞(CPC)の2つの非常に異なる集団、すなわち第1および第2の心臓場(FHFおよびSHF)9、10を含む。SHFからの細胞は非常に増殖性と移動性であり、主に心臓管の伸びとループを担当しています。さらに、SHF細胞は心筋細胞、線維芽細胞、平滑筋および内皮細胞に分化し、心臓管に入り、右心室、右心室流出路および両方の心房7、10の大部分を形成する。対照的に、FHF細胞は、左心室および心房11の小さな部分を生み出すので、主に心筋細胞に分化する増殖性および移動性が低い。さらに、SHF前駆体は、THF細胞がHcn4およびTbx511、12、13、14、15を発現する間、Tbx1、FGF8、FGF10およびSix2の発現によって特徴付けされる。
PSCは、すべての3つの胚芽層に分化し、その後、体内の任意の細胞タイプ4、16に分化することができます。したがって、それらは、心臓の発達を理解し、先天性心疾患をもたらす特定の発達欠陥をモデル化するための大きな可能性を提供し、出生時欠損の最も頻繁な原因17。先天性心疾患の大きなサブグループは、チャンバー特異的な心臓異常18,19を含む。しかし、これらは異常な心臓分野の発達に起因するかどうかは依然として不明である。さらに、出生後に増殖する心筋細胞の能力を考えると、心臓再生1、7、20のための心臓組織を作成するための広範な努力があった。心臓室間の生理的および形態学的な違いを考慮すると、PSCを用いたチャンバー特異的心臓組織の生成は非常に重要である。発達心理学の最近の進歩はPSCからの心臓細胞の堅牢な生成につながったが、2つの心臓界がPSCシステムで誘導できるかどうかはまだ不明である。
体外での心生発生を要約し、CPCの仕様と特性を研究するために、以前にPSC由来心臓スフェロイド21、22、23、24の分化に基づくシステムを使用した。最近では、FHF遺伝子Hcn4とSHF遺伝子Tbx1の制御下でGFPおよびRFPレポーターを用いてマウス胚性幹細胞(MESC)をそれぞれ生成した(mESCTbx1-Cre;ローザ RFP;HCN4-GFP) 25.インビトロ分化MESCは、GFP+およびRFP+細胞が中皮細胞の2つの異なる領域から出現し、相補的な方法でパターン化された心臓スフェロイドを形成した。得られたGFP+およびRFP+細胞は、それぞれRNAシーケンシングおよびクローン解析によって決定されたFHFおよびSHF特性を示した。重要なことに、Isl1-RFPレポーター(mESCIsl1-RFP)を搭載したMESCを用いて、SHF細胞が細胞表面タンパク質CXCR4によって忠実にマークされ、トランスジーンのない心臓場特異的細胞の単離を可能にすることが分かりました。本プロトコルは、室内特異的な心臓病を研究するための貴重なツールとして役立つ可能性のあるMESCからの心臓場特異的CPCの生成と単離について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々のプロトコルでは、心臓スフェロイドおよび単離された心臓場特異的CPCを生成する方法論について説明する。これらは、CPC仕様とその特性のメカニズムを研究するだけでなく、心臓室特異的疾患モデリングのために使用することができます。以前に発表された1つの研究は、2つの蛍光レポーター(Mef2c/Nkx2.5)を用いてmESCラインを用いてインビトロでの心生形成を研究したが、これらのマー?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E. T. はマジック・マターズとAHAによって支えられました。C. K. は NICHD/NIH (R01HD086026)、AHA、および MSCRF からの助成金によってサポートされました。
Materials
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 0.1% (w/v) Gelatin | EMD Millipore | ES-006-B | |
| 100mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 | |
| 100X Pen/Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 1X PBS w/o Calcium and Magnesium | Thermo Fisher Scientific | 21-040-CV | |
| 20% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-493 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tube with a 40μm cell strainer | BD Falcon | 35223 | |
| Activin A | R & D Systems | 338-AC-010 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A-4544 | |
| B27 minus vitamin A (50x) | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BMP4 | R & D Systems | 314-BP | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Cell sorter | Sony | SH800 | Sony or any other fluorescence-activated cell sorter |
| Cell strainer 70μm | Thermo Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Centrifuge Sorvall Legend XT | Thermo Fisher Scientific | 75004508 | |
| CHIR99021 | Selleck chemicals | S2924 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51030285 | |
| Corning Ultra Low Attachment T75 flask | Corning | 07-200-875 | |
| Countless II FL automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | ||
| Donkey anti-mouse IgG secondary antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-31571, Lot #1757130 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose (DMEM) | Gibco | 11965-092 | |
| EDTA | Sigma | E6758 | |
| ESGRO (LIF) | Millipore | ESG1106 | |
| EVOS FL microscope | Thermo Fisher Scientific | AMF4300 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | SH30071.03 | |
| Glasgow’s MEM (GMEM) | Gibco | 11710035 | |
| GlutaMAX (100 x) | Gibco | 35050-061 | |
| Ham’s F12 | Gibco | 10-080-CV | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Monothioglycero (MTG) | Sigma | M-6145 | |
| Mouse anti-Troponin T antibody | Thermo Fisher Scientific | MS-295-P1 | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| Non-essential amino acid solution (NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| PD0325901 | Selleckchem | S1036 | |
| PerCP-efluor 710 conjugated anti-Cxcr4 antibody | Thermo Fisher Scientific | 46-9991-82 | |
| Suspension culture dish 150 mm x 25mm | Corning | 430597 | |
| T25 flasks | Corning | 353109 | |
| TrypLE (Trypsin) | Gibco | 12604 | |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Stem cell technologies | 72304 |
Riferimenti
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