비오틴 라벨을 사용하여 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 생체외 생화학 적 분석을 통해
Summary
여기에 제시된 단백질-핵산 상호작용을 연구하기 위해 널리 적용될 수 있는 비오틴 라벨을 이용한 시험관내 생화학적 분석에 대한 프로토콜이다.
Abstract
단백질 핵산 상호 작용은 전사, 재조합 및 RNA 대사와 같은 생물학적 과정에 중요한 역할을 합니다. 단백질-핵산 상호 작용을 연구하는 실험 방법은 특정 표적 분자를 검출하고 분석하기 위해 형광 태그, 방사성 동위원소 또는 기타 라벨을 사용해야 합니다. 비방사성 핵산 라벨인 비오틴은 전기영동 이동성 이동 분석(EMSA)에 일반적으로 사용되지만 핵산 과정 중 단백질 활성을 모니터링하기 위해 정기적으로 사용되지는 않았습니다. 이 프로토콜은 시험관 내 효소 반응 동안 비오틴 라벨링의 유용성을 보여 주며, 이 라벨이 다양한 생화학 적 분석과 잘 작동한다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 방사성 동위원소 32P표지 기판을 이용한 이전 연구 결과와 일치하여, BIOTin 표지된 EMSA를 통해 MEIOB(특히 메오틱 재조합에 관여하는 단백질)가 DNA 결합 단백질인 MOV10( RNA 헬리콥터)는 비오틴 표지RNA 이중 구조를 해결하고, MEIOB는 바이오틴 표지된 단일 가닥 DNA를 절단한다. 이 연구는 비오틴이 시험관 내에서 다양한 핵산 관련 생화학 적 세포학적 인 세포학적 인 세포학적 인 분석을 32 P로 대체 할 수 있음을 보여줍니다.
Introduction
단백질 핵산 상호 작용은 DNA 복구, 복제, 전사, RNA 처리 및 번역과 같은 많은 필수 세포 프로세스에서 관련시다. 염색질 내의 특정 DNA 서열과의 단백질 상호 작용은 전사 수준 1에서유전자 발현의 엄격한 제어를 위해 요구된다. 수많은 코딩 및 비코딩 RNA의 정확한 사후 상사 조절은 어떤 단백질과 RNA2사이 광범위하고 복잡한 상호 작용을 필요로 합니다. 유전자 발현 조절 메커니즘의 이 층은 그들의 핵산 표적을 가진 전사/후성 유전학 요인 또는 RNA 결합 단백질의 상호 작용에 의해 조정되는 동적 분자 간 사건의 폭포를 포함합니다, 뿐만 아니라 단백질-단백질 상호 작용. 생체 내 단백질이 핵산과 직간접적으로 연관되어 있는지, 그러한 연관성이 어떻게 발생하고 절정에 이르는지 에 대해 해부하기 위해, 시험관내 생화학적 세포학적 인 화학 적 분석을 실시하여 관심 있는 단백질의 결합 친화도 또는 효소 활성을 조사하기 위해 수행됩니다. DNA 및/또는 RNA의 설계 기판.
전기영동성이동분석법(EMSA)을 포함한 핵산-단백질 복합체를 검출하고 특성화하기 위해 많은 기술이 개발되었으며, 겔 지연 분석 또는밴드 시프트 분석법 3,4,5 . EMSA는 핵산과 단백질의 직접 결합을 연구하는 데 널리 사용되는 다재다능하고 민감한 생화학 적 방법입니다. EMSA는 비오틴 라벨6,7, 형광 표지8,9,또는 에 의해 검출하기 위해 화학 발광을 사용하여 일상적으로 시각화되는 밴드의 겔 전기 영동 변화에 의존합니다. 방사성 32P 라벨10,11의자가 방사선 사진 . 생화학적 연구의 다른 목적은 핵산 기질(12)으로부터 의 분열 생성물을 평가하기 위한 뉴클레아제 기반 반응과 같은단백질의 핵산 처리 활성의 식별 및 특성화이다. 13세 , 도 14 및 DNA/RNA 구조-풀림-풀림 검사-헬리콥터 활동을 평가 하는15,16,17.
이러한 효소 활성 검법에서, 방사성 동위원소 표지 또는 형광부 표지 핵산은 그들의 높은 감도로 인해 종종 기질로서 사용된다. 32P 표지된 방사선 추적기를 관련시키는 효소 반응의 방사선 사진의 분석은 민감하고 재현 가능한18인것을 발견되었습니다. 그러나 전 세계적으로 점점 더 많은 실험실에서 방사성 동위원소의 사용은 잠재적 노출과 관련된 건강 위험으로 인해 제한되거나 심지어 금지됩니다. 생체 안전 문제 외에도 방사성 동위원소, 필요한 방사능 허가, 32P의 짧은 반감기 (약 14 일), 프로브 품질의 점진적 저하로 인해 작업을 수행하는 데 필요한 장비가 필요합니다. 방사선 요법. 따라서, 대체 비동위원소 적 방법이 개발되었다(즉, 형광로 프로브에 라벨을 부착하면 형광이미징(19)에의한 검출이 가능하게 된다). 그러나 형광 표지 프로브를 사용할 때는 고해상도 이미징 시스템이 필요합니다. 일반적으로 사용되는 라벨인 비오틴은 단백질과 핵산과 같은 생물학적 거대분자에 쉽게 결합합니다. 비오틴-스트렙타비딘 시스템은 비특이적배경(20,21)을증가시키지 않고 효율적으로 작동하고 검출 감도를 향상시킨다. EMSA 외에, 비오틴은 단백질 정제 및 RNA 풀다운에 널리 사용되며, 그 중에서도22,23,24.
이 프로토콜은 성공적으로 BIOTIN이 일반적으로 사용되지 않은 효소 반응 이외에 EMSA를 포함하는 시험관 내 생화학 분석문을 위한 기질로 비오틴 표지된 핵산을 이용합니다. MEIOB OB 도메인은 생성되고 2개의 돌연변이체(잘림 및 점 돌연변이)는 GST 융합 단백질25,26,27뿐만아니라 마우스 MOV10 재조합 FLAG 융합 단백질16으로발현된다. 이 보고는 그잡다한 실험 목적을 위한 단백질 정제 및 비오틴 표지된 분석실험을 위한 이 결합된 프로토콜의 효과를 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질-핵산 상호 작용을 조사하는 것은 다양한 생물학적 과정의 근본적인 분자 메커니즘에 대한 우리의 이해에 매우 중요합니다. 예를 들어, MEIOB는 포유류25,26,27에서만이기와 불임에 필수적인 고환 특이적 단백질이다. MEIOB는 단일 가닥 DNA에 결합하고 meiotic 재결합 동안 의 생리적 관련성에 직접적으로 관련되는 3′ 5′ 외핵활?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 편집 및 토론에 대한 P. 제레미 왕 (펜실베니아 대학)에 감사드립니다. 우리는 또한 언어 편집시그리드 에카르트에게 감사드립니다. K. Z.는 중국의 국가 핵심 R&D 프로그램(2016YFA0500902, 2018YFC1003500)과 중국 국립자연과학재단(31771653)의 지원을 받았습니다. L. Y.는 중국 국립 자연 과학 재단 (81471502, 31871503)과 장쑤성의 혁신및 기업가 프로그램에 의해 지원되었습니다. J. N. 절강 의료 과학 기술 프로젝트 (2019KY499)에 의해 지원되었다. M. L.은 중국 국립 자연과학 재단(31771588)과 1000청소년 인재 계획의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Equipment | |||
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
| Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
| Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
| Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
| Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
| UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
| Materials | |||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
| Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
| TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
| Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
| Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
| Reagents | |||
| Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
| Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
| ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
| BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
| CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
| ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
| Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
| dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
| DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
| DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
| EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
| EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
| EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
| FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
| FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
| FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
| Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
| GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
| HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
| IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
| KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
| Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
| MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
| NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
| NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
| Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
| PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
| RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
| Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
| TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
| Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
| Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |
Riferimenti
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