यहाँ प्रस्तुत इन विट्रो जैव रासायनिक assays में biotin लेबल है कि व्यापक रूप से प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू हो सकता है का उपयोग कर के लिए प्रोटोकॉल हैं.
प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन जैविक प्रक्रियाओं जैसे प्रतिलेखन, पुनर्संयोजन, और आरएनए चयापचय में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रायोगिक तरीकों का पता लगाने और विशिष्ट लक्ष्य अणुओं का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरोसेंट टैग, रेडियोधर्मी आइसोटोप, या अन्य लेबल के उपयोग की आवश्यकता होती है। बायोटिन, एक गैर-रेडियोएक्टिव न्यूक्लिक एसिड लेबल, आमतौर पर इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता पारी परख (ईएमएसए) में प्रयोग किया जाता है, लेकिन न्यूक्लिक एसिड प्रक्रियाओं के दौरान प्रोटीन गतिविधि की निगरानी के लिए नियमित रूप से नियोजित नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के दौरान बायोटिन लेबलिंग की उपयोगिता दिखाता है, प्रदर्शन है कि इस लेबल विभिन्न जैव रासायनिक assays की एक श्रृंखला के साथ अच्छी तरह से काम करता है. विशेष रूप से, radioisotope 32पी लेबल substrates का उपयोग कर पिछले निष्कर्षों के साथ संरेखण में, यह biotin लेबल EMSA के माध्यम से पुष्टि की है कि MEIOB (एक प्रोटीन विशेष रूप से meiotic पुनर्संयोजन में शामिल) एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन है, कि MOV10 (एक आरएनए हेलीकेस) बायोटिन-लेबल आरएनए डुप्लेक्स संरचनाओं का समाधान करता है, और यह कि एमईओबी क्लीव्स बायोटिन-लेबल एकल-स्ट्रेंड डीएनए। यह अध्ययन दर्शाता है कि बायोटिन विट्रो में विभिन्न न्यूक्लिक एसिड से संबंधित जैव रासायनिक परख में 32पी प्रतिस्थापन करने में सक्षम है।
प्रोटीन न्यूक्लिक एसिड बातचीत डीएनए की मरम्मत, प्रतिकृति, प्रतिलेखन, आरएनए प्रसंस्करण, और अनुवाद के रूप में कई आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं में शामिल हैं। क्रोमैटिन के भीतर विशिष्ट डीएनए दृश्यों के साथ प्रोटीन बातचीत ट्रांसक्रिप्शनल स्तर1पर जीन अभिव्यक्ति के तंग नियंत्रण के लिए आवश्यक है । अनेक कोडन और नॉनकोडिंग आरएनए के सटीक पोस्टट्राप्टेशनल विनियमन के लिए किसी भी प्रोटीन और आरएनए2के बीच व्यापक और जटिल बातचीत आवश्यक होती है . जीन अभिव्यक्ति नियामक तंत्र की इन परतों में गतिशील अंतर-अणुक घटनाओं का एक झरना शामिल है, जो प्रतिलेखन/एपिजेनेटिक कारकों या आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन के अन्योन्यक्रिया द्वारा उनके न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यों के साथ-साथ समन्वित किया जाता है। प्रोटीन प्रोटीन बातचीत. विवो में प्रोटीन प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से न्यूक्लिक एसिड के साथ जुड़े रहे हैं कि क्या विच्छेदन करने के लिए और कैसे इस तरह के संघों होते हैं और समापन, इन विट्रो जैव रासायनिक परख में बाध्यकारी संबंध या ब्याज के प्रोटीन की एंजाइमी गतिविधि की जांच करने के लिए आयोजित की जाती हैं पर डीएनए और / या आरएनए के डिजाइन substrates.
कई तकनीकों का पता लगाने और न्यूक्लिक एसिड प्रोटीन परिसरों की विशेषता विकसित किया गया है, electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) सहित, यह भी जेल मंदता परख या बैंड पारी परख3कहाजाता है ,4,5 . EMSA एक बहुमुखी और संवेदनशील जैव रासायनिक विधि है कि व्यापक रूप से न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन के प्रत्यक्ष बंधन का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. EMSA बैंड में जेल इलेक्ट्रोफोरेटिक बदलाव पर निर्भर करता है, जो नियमित रूप से biotin लेबल का पता लगाने के लिए chemiluminscence का उपयोग कर कल्पना कर रहे हैं6,7, फ्लोरोफोर लेबल के फ्लोरोसेंट लेबल8,9, या द्वारा रेडियोग्राफी 32पी लेबल10,11. जैव रासायनिक अध्ययन के अन्य प्रयोजनों की पहचान और प्रोटीन के न्यूक्लिक एसिड प्रसंस्करण गतिविधि की विशेषता है, इस तरह के न्यूक्लिज आधारित प्रतिक्रियाओं के रूप में न्यूक्लिक एसिड substrates से दरार उत्पादों का आकलन करने के लिए12, 13 , 14 और डी.एन.ए./ संरचना-अनवान् पराख ों को हेलीकेस गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए15,16,17.
इस तरह के एंजाइमी गतिविधि परख में, रेडियोआइसोटोप लेबल या फ्लोरोफोर लेबल न्यूक्लिक एसिड अक्सर उनके उच्च संवेदनशीलता के कारण substrates के रूप में उपयोग किया जाता है। एंजाइमी अभिक्रियाओं के रेडियोग्राफों का विश्लेषण जिसमें 32पी लेबल वाले रेडियोट्रेसर शामिल हैं , संवेदनशील और पुनरुत्पाद्य18पाए गए हैं . फिर भी, दुनिया में प्रयोगशालाओं की बढ़ती संख्या में, रेडियोआइसोटोप का उपयोग प्रतिबंधित है या यहां तक कि संभावित जोखिम के साथ जुड़े स्वास्थ्य जोखिम के कारण निषिद्ध है. जैव सुरक्षा चिंताओं के अलावा, अन्य कमियां रेडियोआइसोटोप, आवश्यक रेडियोधर्मिता लाइसेंस, 32पी (लगभग 14 दिनों) के छोटे आधे जीवन के साथ काम करने के लिए आवश्यक उपकरण हैं, और जांच की गुणवत्ता में क्रमिक गिरावट के कारण रेडियो लिलासिस। इस प्रकार, वैकल्पिक गैर-समस्थानिक विधियों को विकसित किया गया है (अर्थात, फ्लोरोफोर के साथ जांच लेबलिंग फ्लोरोसेंट इमेजिंग19द्वारा पता लगाने में सक्षम बनाता है)। हालांकि, एक उच्च संकल्प इमेजिंग प्रणाली की जरूरत है जब फ्लोरोसेंट लेबल जांच का उपयोग कर. बायोटिन, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला लेबल है, प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड जैसे जैविक मैक्रो अणुओं को आसानी से बांधता है। बायोटिन-स्ट्रेप्टाविडिन प्रणाली कुशलतापूर्वक संचालित होती है और गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि20,21में वृद्धि किए बिना पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करती है। ईएमएसए के अलावा, बायोटिन का व्यापक रूप से प्रोटीन शोधन और आरएनए पुल-डाउन के लिए प्रयोग किया जाता है, अन्य22,23,24के अलावा ।
इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक इन विट्रो जैव रासायनिक परख है कि EMSA शामिल के लिए substrates के रूप में biotin लेबल न्यूक्लिक एसिड का उपयोग करता है, एंजाइमी प्रतिक्रियाओं जिसमें बायोटिन आमतौर पर इस्तेमाल नहीं किया गया है के अलावा. एमआईओबी ओबी डोमेन का निर्माण किया गया है और दो म्यूटेंट (तरुण और बिंदु उत्परिवर्तन ) को जीएसटी संलयन प्रोटीन25,26,27के साथ – साथ माउस MOV10 रिकॉमबिनेंट FLAG संलयन प्रोटीन16के रूप में व्यक्त किया जाता है . इस रिपोर्ट में प्रोटीन शुद्धिकरण और विविध प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए बायोटिन लेबल पराख के लिए इस संयुक्त प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता पर प्रकाश डाला गया.
प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड बातचीत की जांच विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं अंतर्निहित आणविक तंत्र की हमारी समझ के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए, एमईओबी एक वृषण-विशिष्ट प्रोटीन है जो स्तनधारियों में अर्धसूत?…
The authors have nothing to disclose.
हम उपयोगी संपादन और विचार विमर्श के लिए पी जेरेमी वांग (पेन्सिलवेनिया विश्वविद्यालय) धन्यवाद. हम भी भाषा संपादन के लिए Sigrid Eckardt धन्यवाद. के.जेड. चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2016YFA0500902, 2018YFC1003500) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31771653) द्वारा समर्थित किया गया था। एल वाई चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81471502, 31871503) और जियांग्सू प्रांत के अभिनव और उद्यमी कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था। जे एन झेजियांग चिकित्सा विज्ञान और प्रौद्योगिकी परियोजना (2019KY499) द्वारा समर्थित किया गया था। एम एल चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31771588) और 1000 युवा प्रतिभा योजना के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Equipment | |||
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5242R | |
Chemiluminescent Imaging System | Tanon, China | 5200 | |
Digital sonifer | Branson, USA | BBV12081048A | 450 Watts; 50/60 HZ |
Semi-dry electrophoretic blotter | Hoefer, USA | TE77XP | |
Tube Revolver | Crystal, USA | 3406051 | |
UV-light cross-linker | UVP, USA | CL-1000 | |
Materials | |||
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter | Milipore, USA | UFC801096 | 4 ml/10 K |
Nylon membrane | Thermo Scientific, USA | TG263940A | |
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430167 | 100 mm |
TC-treated Culture Dish | Corning, USA | 430597 | 150 mm |
Microtubes tubes | AXYGEN, USA | MCT-150-C | 1.5 mL |
Tubes | Corning, USA | 430791 | 15 mL |
Reagents | |||
Ampicillin | SunShine Bio, China | 8h288h28 | |
Anti-FLAG M2 magnetic beads | Sigma, USA | M8823 | |
ATP | Thermo Scientific, USA | 591136 | |
BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit | Beyotime, China | C3206 | |
CelLyticTM M Cell Lysis Reagent | Sigma, USA | 107M4071V | |
ClonExpress II one step cloning kit | Vazyme, China | C112 | |
Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit | Thermo Scientific, USA | T1269950 | |
dNTP | Sigma-Aldrich, USA | DNTP100-1KT | |
DMEM | Gibco, USA | 10569044 | |
DPBS buffer | Gibco, USA | 14190-136 | |
EDTA | Invitrogen, USA | AM9260G | 0.5 M |
EDTA free protease inhibitor cocktail | Roche, USA | 04693132001 | |
EndoFree Maxi Plasmid Kit | Vazyme, China | DC202 |
|
FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit | Vazyme, China | DC301-01 | |
FBS | Gibco, USA | 10437028 | |
FLAG peptide | Sigma, USA | F4799 | |
Glycerol | Sigma, USA | SHBK3676 | |
GST Bulk Kit | GE Healthcare, USA | 27-4570-01 | |
HEPES buffer | Sigma, USA | SLBZ2837 | 1 M |
IPTG | Thermo Scientific, USA | 34060 | |
KoAc | Sangon Biotech, China | 127-08-02 | |
Lipofectamin 3000 Transfection Reagent | Thermo Scientific, USA | L3000001 | |
MgCl2 | Invitrogen, USA | AM9530G | 1 M |
NaCl | Invitrogen, USA | AM9759 |
5 M |
NP-40 | Amresco, USA | M158-500ML | |
Opti-MEM medium | Gibco, USA | 31985062 | |
PBS | Gibco, USA | 10010023 | PH 7.4 |
RNase Inhibitor | Promega, USA | N251B | |
Streptavidin alkaline phosphatase | Promega, USA | V5591 | |
TBE | Invitrogen, USA | 15581044 | |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15567027 | 1 M, PH 7.4 |
Tris-HCI Buffer | Invitrogen, USA | 15568025 | 1 M, PH 8.0 |
Tween-20 | Sangon Biotech, China | A600560 |