Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la caratterizzazione immunofenotipica e la differenziazione citochina indotta del sangue cordonale derivato CD34- cellule staminali ematopoietiche e progenitrici ai quattro lignaggi mieloidi. Le applicazioni di questo protocollo includono indagini sull'effetto delle mutazioni della malattia mieloide o di piccole molecole sulla differenziazione mieloide del CD34- cellule.
Abstract
La differenziazione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche umane è un modello ampiamente utilizzato per studiare l'ematopoiesi. Il protocollo qui descritto è per la differenziazione indotta da citochine di CD34- cellule staminali ematopoietiche e progenitrici alle quattro cellule di lignaggio mieloidi. CD34- Le cellule sono isolate dal sangue del cordone ombelicale umano e co-coltivate con cellule stromali MS-5 in presenza di citochine. La caratterizzazione immunofenotipica delle cellule staminali e progenitrici e le cellule di lignaggio mieloide differenziate sono descritte. Utilizzando questo protocollo, CD34- Le cellule possono essere incubate con piccole molecole o trasdotte con lentivirus per esprimere mutazioni della malattia mieloide per studiare il loro impatto sulla differenziazione mieloide.
Introduction
La normale differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche (HSC) è fondamentale per il mantenimento dei livelli fisiologici di tutte le linee delle cellule del sangue. Durante la differenziazione, in una risposta coordinata a segnali extracellulari, compresi fattori di crescita e citochine, gli HSC danno prima origine a cellule progenitrici multipotenti (MPP) che hanno un potenziale linfo-mieloide1,2,3 ,4 (Figura 1). I PMP danno origine a progenitori mieloidi comuni (CMP) e a progenitori linfoidi comuni (CLP) con restrizioni di lignaggio. I CLP si differenziano nelle linee linfoidi composte da B, T e cellule killer naturali. I CMP generano le linee mieloidi attraverso due popolazioni progenitrici più ristrette, i progenitori di eritroidi megakaryocyte (MEMP) e i progenitori del monocito del granulocita (GMP). I deputati danno luogo a megakaryociti ed eritrociti, mentre i GMP danno origine a granulociti e monociti. Oltre a sorgere attraverso CP, sono stati segnalati megakaryociti che sorgono anche direttamente dagli HSC o dai primi PMP attraverso percorsi non canonici5,6.
Le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HPG) sono caratterizzate dal marcatore superficiale CD34 e dalla mancanza di marcatori specifici di lignaggio (Lin-). Altri indicatori di superficie che sono comunemente impiegati per distinguere le popolazioni di HSC e progenitrici mieloidi includono CD38, CD45RA e CD1232 (Figura 1). Gli HSC e gli MMP sono rispettivamente Lin,/CD34,/CD38- e Lin-/CD34,/CD38,, e . Le popolazioni progenitorie impegnate da mieloidi si distinguono per la presenza o l'assenza di CD45RA e CD123. I CMP sono Lin-/CD34,/CD38,/CD45RA-/CD123lo, i GMP sono Lin-/CD34,/CD38,/CD45RA,/CD123lo, e i deputati al PE sono Lin-/CD34 /CD38:/CD45RA-/CD123-.
La popolazione totale di cellulestaminali e progenitrici CD34 può essere ottenuta dal sangue del cordone ombelicale umano (UCB), dal midollo osseo e dal sangue periferico. Lecellule CD34 costituiscono lo 0,02% all'1,46% delle cellule mononucleari totali (MNC) nell'UCB umano, mentre la loro percentuale varia tra lo 0,5% e il 5,3% nel midollo osseo ed è molto più bassa allo 0,01% nel sangue periferico7,8,9 . La capacità proliferale e il potenziale di differenziazione dellecellule CD34 derivate dall'UCB è significativamente superiore a quello del midollo osseo o delle cellule del sangue periferiche1,10, offrendo così un netto vantaggio per ottenere un vantaggio distinto per ottenere materiale sufficiente per analisi molecolari in combinazione con l'esecuzione di immunofenotipica e caratterizzazione morfologica delle cellule durante la differenziazione.
La differenziazione dell'ex vivo del sangue del cordone ombelicale derivato da CD34- HSPC è un modello ampiamente applicato per studiare la normale ematopoiesi e i meccanismi della malattia ematopoietica. Quando viene coltivato con le citochine appropriate, l'UCB CD34- HSPC può essere indotto a differenziarsi lungo le linee mieloidi o linfoidi11,12,13,14,15 , 16. Qui, descriviamo i protocolli per l'isolamento e la caratterizzazione immunofenotipica del CD34- HSPC dall'UCB umano, e per la loro differenziazione alle cellule di lignaggio mieloidi. Questo sistema di coltura si basa sulla differenziazione degli HSPC indotta da citochine in presenza di cellule stromali MS-5 per imitare il microambiente nel midollo osseo. Le condizioni di coltura causano un'espansione iniziale dellecellule CD34, seguita dalla loro differenziazione alle cellule che esprimono marcatori per le quattro cellule di lignaggio mieloidi, vale a dire granulociti (CD66b), monociti (CD14), megakaryociti (CD41) e eritrociti (CD235a). Le applicazioni del protocollo di differenziazionecellulare CD34 include studi sui meccanismi molecolari che regolano l'ematopoiesi e le indagini sull'impatto delle mutazioni associate alla malattia mieloide e delle piccole molecole sull'auto-rinnovamento e differenziazione degli HSPC.
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Protocol
Il sangue del cordone ombelicale umano per la sperimentazione è stato donato da individui sani dopo il consenso informato a Maricopa Integrated Health Systems (MIHS), Phoenix. Le unità identificate sono state ottenute attraverso un accordo di trasferimento di materiale tra MIHS e l'Università dell'Arizona.
1. Reagenti e buffer
NOT: Preparare tutti i reagenti e le tamponamenti in condizioni sterili in un armadietto di sicurezza biologica.
- Preparare il buffer sterile PBS-BSA-EDTA (PBE) aggiungendo 7,2 mL di albumina sterile 35% di siero bovino (BSA; utilizzare la coltura dei tessuti sterili grado 35% BSA) e 5 mL di sterile 0,5 M di diamine tetra acetica (EDTA) a 487.8 mL di fofoso tampone sterile dulbecco salina (DPBS). Filtrare sterilizzare e de-gas il tampone lasciando il filtro attaccato al vuoto in un armadietto di sicurezza biologico per almeno 2 h. il tampone de-gassato in volumi più piccoli (250 mL) e conservare a 4 gradi centigradi.
- Preparare 1x Hanks soluzione di sale equilibrato (1x HBSS). Diluire 100 mL di 10x di brodo HBSS in 900 mL di acqua distillata sterile per fare 1 L di 1x HBSS e regolare il pH a 7,2. Filtro sterilizzare il 1x HBSS prima dell'uso.
- Preparare la soluzione del 2% dell'acido acetico aggiungendo 2 mL di acido acetico glaciale a 98 mL di acqua distillata.
- Preparare la soluzione di frammento di fibronectina umana a 20 ng/mL in 1x PBS. Fare 10 mL per 48-bene piastra.
- Preparare il 2% di BSA. A 100 mL 1x PBS, aggiungere 2 grammi di BSA frazione V. Filtro sterilizzare prima dell'uso.
- Rendi completo il mezzo DMEM (Modified Eagle) di Dulbecco aggiungendo la polvere DMEM, il bicarbonato di sodio da 3,7 gx, il siero bovino fetale (FBS) da 100 mL e la penicillina-streptomicina (PS) a 800 mL di acqua sterile distillata. Mescolare e fare il volume a 1 L, e filtrare sterilizzare prima dell'uso.
- Preparare il mezzo di congelamento mescolando 90 mL di FBS e 10 mL di solforo dimetilo sterile (DMSO).
- Preparare il mezzo di stimolazione. Per siero medio libero, aggiungere l-glutamina a 2 mM, e citochine a una concentrazione finale di 50 ng/mL per fattore di cellule staminali (SCF), trombopoipoietina (TPO), e la cisino di tipo Fms-like 3 ligando (Flt3L), e 20 ng/mL per l'interleuina-3 (IL3) (vedere Tabella dei materiali per la preparazione di soluzioni stock di citochine). Fare 5 mL per 48-bene piastra.
- Preparare 1x mezzo di differenziazione mieloide. Per completare DMEM, aggiungere citochine a una concentrazione finale di 5 ng/mL per SCF, Flt3L e IL3, 50 ng/mL per TPO e 4 unità/mL per erythropoietin (EPO). Fare 5 mL per 48-bene piastra.
- Preparare 2x mezzo di differenziazione mieloide. Per completare DMEM, aggiungere citochine a una concentrazione finale 10 ng/mL per SCF, Flt3L e IL3, 100 ng/mL per TPO e 8 unità/mL per EPO. Fare 5 mL per 48-bene piastra.
- Preparare il buffer della citometria di flusso. A 1 L di 1x PBS, aggiungere 10 g di BSA frazione V.
- Preparare l'1% di paraformaldeide in 1x PBS (vedere Tabella dei materiali per i dettagli).
- Preparare la soluzione poli-L-lisina aggiungendo 500 luna di 10 mg/mL poli-L-lysine a 49,5 mL di 1x PBS.
2. Isolamento delle cellule mononucleari dal sangue delle corde ombelicali
NOT: Per il protocollo descritto di seguito, sono stati utilizzati volumi di sangue cordonale da 90 a 100 mL. L'isolamento dellecellule CD34 deve essere eseguito in condizioni sterili in un armadietto di sicurezza biologica.
- Spruzzare il sacchetto contenente UCB con 70% di etanolo per sterilizzare la superficie esterna prima di introdurla nell'armadietto di sicurezza biologico. Trasferire l'UCB in una bottiglia di plastica sterile da 250 ml e diluirla 1:1 aggiungendo un volume uguale di temperatura ambiente (RT) 1x HBSS.
- Distribuisci 15 mL di mezzo frazionato MNC (MFM; vedi Tabella deimateriali) per tubo in circa sei sterili tubi conici da 50 mL. Inclinare il tubo con MFM e versare delicatamente 30 mL di UCB diluito sullo strato MFM senza disturbarlo.
- Centrifugare i tubi a 400 x g per 30 min a RT con accelerazione lenta e nessun freno.
- Dopo la centrifuga, aspirare tra 15-20 mL del plasma sopra lo strato di MNC. Raccogliere delicatamente gli MNC con una pipetta e trasferirli in un nuovo tubo conico da 50 mL.
NOT: MNC depositano come strato di buffy bianco all'interfaccia del plasma e dell'MFM, e il sedimento dei globuli rossi (RBC) nella parte inferiore del tubo conico. - Pool MNC raccolti da 2-3 tubi insieme. Fare il volume di ogni tubo a 50 mL con tampone PBE freddo.
- Centrifugare i tubi a 300 x g per 10 min a 4 gradi centigradi, con il freno basso.
- Aspirare il supernatante e toccare delicatamente il tubo per allentare il pellet cellulare.
- Sospendere nuovamente le cellule pellete in 5 mL di tampone PBE freddo ghiaccio. Utilizzare gli stessi 5 mL di cellule risospese per raccogliere cellule da altri tubi. Unire le cellule da 3 a 4 tubi insieme in un tubo conico da 50 mL.
- Per raccogliere le cellule rimanenti, lavare tutti i tubi con 5 mL di tampone PBE freddo e aggiungere al tubo conico 50 mL.
- Contare le MNC diluindo 10 -L di sospensione cellulare in una soluzione di acido acetico da 490 ll.
NOT: L'acido acetico lisse qualsiasi RBC contaminato per consentire un più facile conteggio delle MNC. - Comprendi il volume della sospensione cellulare a 50 mL con tampone PBE ghiacciato. Centrifugare le cellule a 300 x g per 10 min a 4 gradi centigradi, con freno basso.
NOT: La sospensione MNC può essere elaborata immediatamente per l'isolamento di CD34- cellule o congelato per applicazioni successive. - Per congelare gli MNC, rimuovere il supernatante e ri-sospendere ad una densità di 2 x 107 celle / mL in mezzo di congelamento a RT.
- Congelare le cellule a -80 gradi centigradi durante la notte in un contenitore di congelamento cellulare e trasferirle in azoto liquido.
3. Isolamento di CD34- Cellule da celle mononucleari
- Se si utilizzano MNC appena isolate procedere direttamente al passaggio 3.3.
- Se si utilizzano MNC congelati, scongelare rapidamente le celle congelate in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e trasferirle in un tubo conico da 50 mL. Raccogliere le celle rimanenti nelle fiale con 1 mL di tampone PBE ghiacciato e trasferirle al tubo conico da 50 mL.
- Comprendere il volume della sospensione MNC a 50 mL con tampone PBE freddo e centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Rimuovere il supernatante e toccare delicatamente il tubo per allentare il pellet cellulare. Sospendere nuovamente gli MNC a 1 x 108 celle in 300 - L di tampone PBE ghiacciato.
- Aggiungete 100 l di RFC bloccando il reagente dal kit di microsfera umano CD34 attivato a magnetica e mescolate delicatamente.
NOT: Questo blocca l'associazione non specifica alle microsfere CD34. - Aggiungete 100 l delle microsfere CD34 per 1 x 108 cellule. Mescolare delicatamente e incubare a 4 gradi centigradi per 30 min in frigorifero. Non incubare sul ghiaccio.
- Durante l'incubazione delle cellule, posizionare una colonna LS e un filtro di pre-separazione nel campo magnetico del separatore MACS. Equilibrate la colonna con tampone PBE ghiacciato aggiungendo 2 mL direttamente nella colonna e 1 mL nel filtro di pre-separazione. Lasciare svuotare la colonna in un tubo conico da 15 mL e scartare il flusso.
- Togliere gli MNC a partire da 4 gradi centigradi, aggiungere il tampone PBE ghiacciato per fare il volume a 15 mL e centrificare le cellule a 300 x g per 10 min a 4 gradi centigradi, con il freno basso.
- Aspirare il supernatante e ri-sospendere le cellule in 1 mL di tampone PBE ghiacciato.
- Aggiungere la sospensione cellulare al filtro di pre-separazione posizionato sulla colonna LS.
NOT: Il filtro di pre-separazione rimuove tutte le aggregazioni di celle di grandi dimensioni che potrebbero bloccare la colonna. - Risciacquare il tubo con 3 mL di tampone PBE ghiacciato e aggiungerlo al filtro di pre-separazione posto sulla colonna LS. Dopo di che, scartare il filtro di pre-separazione.
- Lavare la colonna LS quattro volte aggiungendo 3 mL di tampone PBE ghiacciato, permettendo alla colonna di defluire ogni volta.
NOT: Le celle CD34- rimarranno associate alla colonna e le celle senza etichetta scorreranno attraverso la colonna. - Dopo il lavaggio finale, rimuovere la colonna dal campo magnetico separatore MACS e posizionarla in un nuovo tubo conico da 15 mL, lontano dal magnete.
- Aggiungere il buffer PBE ghiacciato da 5 mL alla colonna ed espellere lecelle CD34 rilegate spingendo saldamente nello stantuffo.
- Facoltativamente, passare CD34: celle isolate dalla prima colonna su un'altra colonna LS con il filtro di pre-separazione come descritto in precedenza (passaggi 3.10-3.13).
- Contare le cellule isolate CD34- con il blu trypan (10 , luna di cellule e 10 lof di blu trypan) per determinare il numero totale di cellule vive.
NOT: In questa fase, lecellule isolate CD34 possono essere congelate per un uso successivo o possono essere elaborate direttamente per l'analisi degli HSPC mediante citometria di flusso (sezione 4) o per differenziazione alle cellule di lignaggio mieloidi (sezione 5). - Centrifugare la sospensione cellulare a 600 x g per 5 min a RT, con freno basso.
- Per congelare lecelle CD34, aspirare il super-natante e sospendere nuovamente fino a 5 x 106 celle in 1 mL di mezzo di congelamento e congelare come descritto sopra (passaggio 2.13). In caso contrario, procedere alla sezione 4 o 5.
4. Determinazione delle popolazioni staminali e progenitorie da parte della citometria di flusso
- Per determinare le frazioni delle popolazioni di steli e progenitrici nel CD34 appena isolato: HPC, centrificarle a 600 x g per 5 min e sospendere nuovamente 1 x 106 cellule in 50 : L di buffer di citometria a flusso.
- A 1 x 106 CD34- cellule, aggiungere anticorpi (vedere Tabella dei materiali per le diluizioni) ai marcatori di lignaggio (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 e CD235a - tutti i FITC etichettati), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (A) e 7-- Cy7 aminoactinomicina D (7-AAD; come una macchia vivo / morto) e costituiscono il volume totale a 100 . Incubare sul ghiaccio al buio per 20 min.
NOT: Per l'analisi possono essere impiegate meno di 1 x 106 CD34. Se si macchia un numero inferiore di cellule, il volume totale e il volume degli anticorpi aggiunti devono essere ridotti di conseguenza. Per l'analisi della citometria a flusso, le MNC non macchiate e singole colorate devono essere utilizzate come controlli per l'impostazione di porte positive e negative per ogni fluoroforo. - Dopo l'incubazione, lavare le cellule con 1 mL di tampone di citometria a flusso e centrifugare a 600 x g per 5 min.
- Facoltativamente, fissare le cellule colorate in 0,5 mL di 1% soluzione di paraformaldeide per 10 min al buio a RT.
- Centrifuga a 600 x g per 5 min e aspirare il supernatante.
- Lavare le cellule fisse/colorate con 1 mL di tampone di citometria a flusso e centrifugare a 600 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Aspirati il supernatante, sospendete nuovamente le cellule in 500 - L di buffer di citometria di flusso e analizzerate da un citometro di flusso (Tabella dei materiali).
5. Differenziazione mieloide del CD34- Cellule staminali e semigenitiche
NOT: Per differenziare il CD34- HSPC alle cellule di lignaggio mieloidi, vengono prima stimolati in piastre rivestite di frammenti di fibronectina umana ricombinanti e poi seminato su uno strato di cellule stromali MS-5 nel mezzo di differenziazione mieloide. La differenziazione può essere monitorata ogni settimana per 3 settimane sulla base dell'espressione di indicatori di superficie cellulare specifici per i quattro lignaggi mieloidi. Durante la stimolazione e la differenziazione, tutte le incubazioni vengono eseguite a 37 e al 5% di CO2 in una camera umidificata. Tutte le fasi devono essere eseguite in un armadietto di sicurezza biologica.
- Rivestire i pozzetti di una piastra sterile non rivestita di 48 pozzetti aggiungendo 200 gradi/acqua di soluzione di fibronectina umana ricombinante in 1x PBS per 2 h a RT.
- Dopo 2 h, rimuovere con attenzione la soluzione fibronectina umana ricombinante e scartare.
- Bloccare i pozze con 200 l/po di 2% BSA per 30 min a RT.
- Aspirare la soluzione BSA e lavare i pozzetti due volte con 500 luna di sterile 1x PBS.
NOT: Le placche rivestite a frammento di fibronetina possono essere conservate a 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane. - Per stimolare gli HSPC CD34, sospendere nuovamente le cellule appena isolate (dal punto 3.17) ad una densità di 1 x 105 cellule/200 o 5 x 105 celle/mL del mezzo di stimolazione 1x caldo.
- Se si utilizzanole cellule CD34 congelate, scongelare rapidamente e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 mL contenente DMEM caldo completo. Centrifuga a 600 x g per 5 min e ri-sospendere le cellule come descritto nel passaggio 5.5.
- Piastra 200 - L del CD34- sospensione cellulare per pozzo del frammento di fibronectina rivestito 48 pozzetti e incubato per 48 h.
- Il giorno successivo, seme 15.000 cellule stromali MS-5 in 200 - L di DMEM completo per pozzo di una piastra trattata con 48 pozzetti e incuba a 37 gradi centigradi per 24 ore.
- Dopo 48 h di stimolazione, raccogliere lecellule CD34 con un leggero pipettaggio. Lavare i pozze con 500 gradi di DMEM caldo e piscina con la sospensione cellulare.
- Conta le celle con trypan blu. Centrifugare la sospensione a 600 x g per 5 min e ri-sospendere ad una densità di 5.000 cellule/200 l di 1x mezzo di differenziazione mieloide.
- Dalla piastra di coltura dei tessuti di 48 pozzetti con cellule stromali MS-5, aspirare delicatamente il mezzo senza disturbare le cellule. Strato 200 L (5.000 cellule) del CD34: sospensione cellulare per pozzo della piastra e incubare a 37 gradi centigradi.
NOT: La coltura di cellule MS-5 può essere mantenuta in dMEM completo. Il giorno in cui le cellule CD34sono semi, le cellule MS-5 devono essere in uno strato uniforme (80-90% confluenza). Si raccomanda che le cellule MS-5 siano placcate almeno 24 ore prima della semina dellecellule CD34. Se le cellule MS-5 devono essere placcate 48 h o 72 h prima di eseguire il seeding dellecellule CD34, la densità delle cellule deve essere regolata di conseguenza. Si raccomanda inoltre che i pozzi periferici della piastra di 48 pozzetti siano lasciati vuoti o riempiti con 200 - L di acqua sterile per evitare effetti di bordo. - Eseguire un cambio medio-medio ogni 3/4 giorni rimuovendo delicatamente 100 l'uno del mezzo dalla parte superiore di ogni pozzo e sostituendolo con 100 ll di 2x mezzo di differenziazione mieloide per pozzo.
- Il giorno 21, raccogliere le cellule per l'analisi dell'espressione del marcatore di lignaggio mieloide per citometria di flusso. Senza disturbare lo strato MS-5, pipette delicatamente il mezzo e trasferire le cellule a un tubo 5 mL.
NOT: Per l'analisi della citometria di colorazione e flusso, le cellule da 1-2 pozzi sono sufficienti. La differenziazione può anche essere monitorata nei giorni 1, 7 e 14. Se si esegue l'immunofenotipizzazione su più giorni, il numero di pozzi necessari per l'analisi deve essere calcolato di conseguenza. - Macchia 5 x 105 cellule con anticorpi contro CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5) e CD235a (APC) in un volume totale di 50 unità di incubazione sul ghiaccio al buio per 20 min. cancelli positivi e negativi per ogni fluoroforo, e 7-AAD come una macchia vivo / morto per eliminare le cellule morte dall'analisi.
- Lavare e fissare (opzionale) le cellule colorate come descritto in precedenza (passaggi 4.3-4.6).
- Sospendere nuovamente le cellule in 500 - L di buffer di citometria di flusso e analizzare da un citometro di flusso.
6. Valutazione della morfologia cellulare
- Pulire i vetrini al microscopio spruzzando etanolo e asciugando fino a schiaffenziare.
- Immergere i vetrini puliti in soluzione poli-L-lisina per 5 min a RT e asciugare per 1 h a RT.
- Risospendere gli HSPC dal passaggio 3.14 e le celle differenziate dal passaggio 5.13 in 10 - L di buffer citometria di flusso.
- Trasferire le sospensioni cellulari ai vetrini rivestiti e lasciarli asciugare all'aria.
NOT: Le diapositive del primo e del 21 del giorno possono essere conservate al RT e macchiate contemporaneamente. - Versare 0,5 mL della macchia Wright-Giemsa sullo scivolo e lasciare riposare per 3 min a RT.
- Aggiungere lo stesso volume di acqua deionizzata e lasciare riposare per ulteriori 10 min a RT.
- Lavare lo scivolo in acqua deionizzata.
- Visualizzare le cellule colorate con un ingrandimento di 60x o 100x al microscopio.
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Representative Results
L'applicazione dei protocolli di cui sopra produce 5,6 (z 0,5) x 108 MNC e 1 (0,3) x 106 CD34, cellule da un'unità di sangue cordonale di 100 mL. La percentuale del totale di CD34- celle varia tra 80-90% (Figura2A,B). L'analisi immunofenotipica da parte dello schema descritto da Manz et al.5 dimostra che le cellule CD34sono in genere costituite da HSC del 20% e da MMP che sono Lin-/CD34-/CD38- e Lin-/CD34 /CD38:, rispettivamente (Figura 1 e Figura 2A). Nella popolazione MPP, le percentuali dei CMP (Lin-/CD34,/CD38,/CD123lo/CD45RA-), i GMP (Lin- /CD34)/CD38,/CD123lo/CD45RA) e gli eurodeputati (Lin-/CD34,/CD38,/CD123-/CD45RA-) sono rispettivamente del 25% e del 15% circa (Figura 1 e Figura 2B).
Durante l'incubazione degli HSPC isolati in condizioni di differenziazione mieloide, c'è una progressiva perdita del marcatore CD34. L'immunofenityping mostra che la percentuale di CD34- cellule si riduce dal 90% all'isolamento (Figura 2A) a 23% il giorno 21 (Figura 3B). Analisi del CD34- popolazione dimostra un aumento concomitante della percentuale di cellule che esprimono marcatori di lignaggio mieloide maturo. C'è un aumento della percentuale di cellule che esprimono marcatori per i monociti (CD34-/CD14-/CD66b- )da una media di 1,7% al 12%, per i granulociti (CD34-/CD14-/CD66b)da 1,3% a 5,3%, per megakaryocites (CD34-/CD41-/CD235a- )dall'1,8% all'8% e per le celle eritroidi (CD34-/CD41-/CD235a)dallo 0,7% all'11% (Figura 3C). L'esame delle cellule colorate di Wright-Giemsa dimostra che le caratteristiche morfologiche delle cellule il giorno 1 e il giorno 21 sono distinte. Le cellule indifferenziate hanno grandi nuclei rotondi e pochissimo citoplasma. D'altra parte, le cellule provenienti da colture differenziate presentano caratteristiche di cellule di lignaggio, tra cui monociti maturi, granulociti ed erithroblasts (Figura 4). Così, le condizioni di coltura descritte in questo protocollo promuovono la differenziazione dell'UCB CD34- cellule alle cellule di lignaggio mieloide.
Figura 1 : Schema di differenziazione ematopoietico. La cellule staminali ematopoietiche pluripotenti (HSC) si differenzia nel progenitore multipotente (MPP), che dà origine alle cellule comuni del progenitore mieloide (CMP) e alle cellule progenitrici linfopidi comuni (CLP). I CMP generano altri due progenitori mieloidi, i progenitori monociti dei granulociti (GMP) e i progenitori di eritrociti megakaryociti (MEP). I granulociti e i monociti nascono dai GMP e dagli eritrociti e dai megakaryociti nascono dagli eurodeputati. I CLP danno origine a cellule killer naturali, B e T. Sono indicati i marcatori di superficie delle celle utilizzati per caratterizzare le popolazioni di cellule in questo protocollo. Questa cifra è stata modificata da Bapat et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Analisi immunofenotipica delle cellule staminali ematopoietiche e progenitrici. (A) Le celle sono state gated sulla dispersione in avanti e lateralmente per selezionare una popolazione a cella singola. Le cellule positive morte e lignaggio sono state eliminate colorando con 7-AAD e anticorpi verso CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 e CD235a (tutte le macchie FITC). Le cellule Lin-/live sono state analizzate con anticorpi contro CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD123 (APC) e CD45RA (PE-Cy7). I progenitori si distinguevano dallecelle CD34 -CD38. I CMP sono CD123lo/CD45RA-, i GMP sono CD123lo/CD45RA- e gli Eurodeputati sono CD123-/CD45RA-. Vengono mostrati i grafici a dispersione rappresentativi di un esperimento. (B) Sono rappresentate percentuali del totale degli HSPC (totale CD34- cellule), Dei CPC, dei GPC e dei deputati al Secondo nel sangue cordonale. I dati presentati sono medie con errore standard da almeno tre esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi immunofenotipica delle cellule di lignaggio mieloidi. Le celle singole erano recintate in base alla dispersione in avanti e laterale. CD34- le cellule sono state selezionate colorando con anticorpo a CD34 (APC-Cy7). Linee mieloidi nel CD34- popolazione sono stati analizzati con anticorpi a CD14 (PE), CD66b (PE-Cy7), CD41 (PerCP-Cy5.5), e CD235a (APC) il giorno 1 (A) e giorno 21 (B). I monociti sono CD14-/CD66b-, i granulociti sono CD14-/CD66b,megakaryocytes sono CD41-/CD235a- e le celle eritroidi sono CD41-/CD235a. Vengono mostrati i grafici a dispersione rappresentativi di un esperimento. Frazioni di monociti, granulociti, megakaryociti ed eritroidi nel CD34- popolazione il giorno 1 e il giorno 21 sono rappresentati (C). I dati presentati sono medie con errore standard da almeno tre esperimenti indipendenti. Questa cifra è stata modificata da Bapat et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : immagini rappresentative di HPC e celle differenziate. CD34- HSPN (A) e cellule provenienti da colture mieloidi al giorno 21 (B) sono state macchiate con la macchia Wright-Giemsa. Vengono visualizzate le celle corrispondenti ai granulociti (frecce nere), monociti (frecce blu) e celle eritroidi (frecce rosse). Le barre della scala rappresentano 10 mm. Questa cifra è stata modificata da Bapat et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo qui descritto è adatto per la differenziazione ex vivo di CD34 derivati dall'UCBe hSPC ai quattro lignaggi mieloidi. L'incubazione iniziale con un mix di citochine composto da SCF, TPO, Flt3L e IL3 stimola lecellule CD34. Successivamente, la differenziazione si ottiene con un cocktail di SCF, IL3, Flt3L, EPO e TPO. In questo mix, SCF, IL3 e Flt3L sono importanti per la sopravvivenza e la proliferazione di CD34- HSCs. EPO e TPO promuovono la differenziazione verso gli eritrociti e megakaryocytes, rispettivamente, e IL3 promuove la differenziazione dei primi granulociti-monoti precursori e cellule mature13,17,18. Un avvertimento a questo metodo è la variazione osservata nelle percentuali di cellule differenziate. Ciò potrebbe essere dovuto alle differenze nelle capacità del CD34- HSPC isolati da donatori diversi per dare origine alle cellule di lignaggio.
Lo strato di cellule MS-5 è fondamentale per una differenziazione efficiente del CD34- HSPC. Nella nostra esperienza, le cellule MS-5 devono essere placcate almeno 24 ore prima della semina del CD34- cellule. È importante mantenere la confluenza delle cellule MS-5 all'80-90%. Le cellule MS-5 sovraccariche tendono a staccarsi e la confluenza più bassa causa una minore differenziazione. Durante l'incubazione, le cellule CD34si espandono di 50 volte. Diventano confluenti di giorno 14 e devono essere raccolti e divisi in pozzi aggiuntivi contenenti cellule MS-5 su un nuovo piatto.
La frequenza dei cambiamenti dei media è anche fondamentale per una differenziazione efficiente e deve essere eseguita ogni 3-4 giorni per mantenere concentrazioni ottimali di citochine. Meno cambiamenti dei media e concentrazioni di citochine più basse, entrambi causano una riduzione della proliferazione e la differenziazione di CD34- HPC. Questo requisito per grandi quantità di citochine può aumentare significativamente i costi e quindi, è una limitazione di questo protocollo. Un'altra limitazione per gli esperimenti su larga scala è il numero di CD34- cellule ottenute da un'unità di sangue cordonale. In genere, una nuova unità UCB di 100 mL produce circa un milione dicellule CD34. Lo stoccaggio dell'unità oltre le 24 ore riduce significativamente la resa. Un'ulteriore perdita di purezza del CD34- le cellule possono verificarsi durante le fasi di lavaggio della colonna che sono importanti per rimuovere eventuali cellule contaminanti non etichettate. Se la colonna si ostruisce durante i passaggi di lavaggio, si consiglia di eluire e ricaricare le celle associate della colonna ostruita su una nuova colonna per ottenere una popolazione pura dicellule CD34.
Nella letteratura, sono state segnalate diverse combinazioni di citochine che promuovono la differenziazione verso il megakaryocitico, l'erittroide o le linee granulo-monocite19,20,21,22 . Un vantaggio di questo protocollo è che permette la differenziazione lungo tutte e quattro le popolazioni mieloidi, vale a dire monociti, granulociti, megakaryociti ed eritrociti. Così, può essere impiegato per studiare la normale differenziazione mieloide e per studiare l'impatto della malattia mieloide (sindromi mielodiplastiche, leucemia mieloide acuta, neoplasmi mieloproliferativi, e altri) mutazioni puntiformi associati e traslocazioni cromosomiche sul fenotipo molecolare e cellulare durante la proliferazione e la differenziazione di CD34: cellule11,12,23,24,25. Questo protocollo può essere impiegato anche per esaminare l'impatto delle citochine anti-infiammatorie e dei potenziali farmaci terapeutici sulla differenziazione mieloide26,27,28.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Wendy Barrett, Rachel Caballero e Gabriella Ruiz di Maricopa Integrated Health Systems per le unità di sangue cordonale de-identificate e donate, Mrinalini Kala per l'assistenza con la citometria di flusso, e Gay Crooks e Christopher Seet per consigli sulla differenziazione dei mieloidi ex vivo. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi per S.S. dal National Institutes of Health (R21CA170786 e R01GM127464) e dall'American Cancer Society (il Institutional Research Grant 74-001-34-IRG). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
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