Summary
Burada, dört miyeloid soya immünotipik karakterizasyon ve sitokin kaynaklı cd34+ hematopoetik kök ve ataat hücrelerinin farklılaşması için bir protokol sıyoruz. Bu protokolün uygulamaları cd34+ hücrelerin miyeloid farklılaşması üzerinde miyeloid hastalık mutasyonları veya küçük moleküllerin etkisi üzerine araştırmalar içerir.
Abstract
İnsan hematopoetik kök hücrelerinin ex vivo farklılaşması hematopoezisi incelemek için yaygın olarak kullanılan bir modeldir. Burada açıklanan protokol CD34+ hematopoetik kök ve ata hücrelerinin dört miyeloid soy hücresine sitokin kaynaklı farklılaşması içindir. CD34+ hücreler insan göbek kordon kanIzole ve sitokinler varlığında MS-5 stromal hücreleri ile birlikte kültürlü. Kök ve progenitor hücrelerinin immünonotitipik karakterizasyonu ve diferansiye miyeloid soy hücreleri tanımlanmıştır. Bu protokolü kullanarak, CD34+ hücreleri küçük moleküller ile kuluçkaya ya da miyeloid hastalık mutasyonları miyeloid farklılaşma üzerindeki etkilerini araştırmak için lentivirüsler ile transduced olabilir.
Introduction
Hematopoetik kök hücrelerin (HSC) normal farklılaşması tüm kan hücresi soylarının fizyolojik düzeylerinin sürdürülmesi için önemlidir. Farklılaşma sırasında, büyüme faktörleri ve sitokinler de dahil olmak üzere hücre dışı ipuçlarına eşgüdümlü bir yanıt olarak, HSC'ler ilk lenfo-miyeloid potansiyele sahip çok güçlü progenitor (MPP) hücrelerine yol açar1,2,3 ,4 (Şekil 1). MPP'ler, soy kısıtlamalı yaygın miyeloid atalara (KP) ve yaygın lenfoid atalara (KPS) yol açar. CLP'ler B, T ve doğal öldürücü hücrelerden oluşan lenfoid soylara ayrılırlar. CMP'ler iki daha kısıtlı ata popülasyonu, megakaryosit eritroid ataları (MEP) ve granülosit monosit ataları (GDO) yoluyla miyeloid soyları oluştururlar. MEP'ler megakaryositve eritrositlere yol açarken, GDO'lar granülosit ve monositlere yol açar. CMPs ile kaynaklanan ek olarak, megakaryositler de doğrudan HSCs veya erken MPPs olmayan kanonik yollar üzerinden ortaya bildirilmiştir5,6.
Hematopoetik kök ve ata hücreleri (HSPCs) yüzey marker CD34 ve soy ait belirteçlerin eksikliği ile karakterizedir (Lin-). HSC'leri ve miyeloid ata popülasyonlarını ayırt etmek için yaygın olarak kullanılan diğer yüzey belirteçleri CD38, CD45RA ve CD123 2'dir (Şekil 1). HSC'ler ve MPP'ler Lin-/CD34+/CD38- ve Lin-/CD34+/CD38+, sırasıyla. Myeloid kararlı ata popülasyonları CD45RA ve CD123 varlığı veya yokluğu ile ayırt edilir. CMP'ler Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA-/CD123lo, GMP'ler Lin-/CD34+/CD38+/CD45RA+/CD123lo, ve MEP'ler Lin-/CD34+ /CD38+/CD45RA-/CD123-.
CD34+ kök ve ata hücrelerinin toplam popülasyonu insan göbek kordon kanı (UCB), kemik iliği ve periferik kan elde edilebilir. CD34+ hücreler insan UCB'deki toplam mononükleer hücrelerin (MNC) %0,02 ila %1,46'sını oluştururken, bunların yüzdesi kemik iliğinde %0,5 ile %5,3 arasında değişir ve periferik kanda ~%0,01'de çok daha düşüktür7,8,9 . UCB türetilmiş CD34+ hücrelerin proliferatif kapasitesi ve farklılaşma potansiyeli önemli ölçüde kemik iliği veya periferik kanhücrelerinin1,10, elde etmek için ayrı bir avantaj sunan daha yüksektir farklılaşma sırasında hücrelerin immünophenotipik ve morfolojik karakterizasyonu ile birlikte moleküler analizler için yeterli malzeme.
Göbek kordon kanı kaynaklı CD34+ HSPCs ex vivo farklılaşma normal hematopoezis ve hematopoetik hastalık mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak uygulanan bir modeldir. Uygun sitokinler ile kültürlü zaman, UCB CD34+ HSPCs miyeloid veya lenfoid soy11,12,13,14,15 boyunca ayırt etmek için indüklenebilir , 16- Burada, CD34+ HSPC'lerin insan UCB'sinden izolasyon ve immünophenotipik karakterizasyonu ve bunların miyeloid soy hücrelerine farklılaşması protokollerini açıklıyoruz. Bu kültür sistemi, kemik iliğindeki mikro ortamı taklit etmek için MS-5 stromal hücrelerinin varlığında HSP'lerin sitokin kaynaklı farklılaşmasına dayanır. Kültür koşulları CD34+ hücrelerin ilk genişlemesine neden olur, ardından dört miyeloid soy hücresi için belirteçleri ifade eden hücrelere farklılaşmaları, yani granülositler (CD66b), monositler (CD14), megakaryositler (CD41) ve eritrositler (CD235a). CD34+ hücre farklılaştırma protokolünün uygulamaları, hematopoeziyi düzenleyen moleküler mekanizmalar üzerine yapılan çalışmaları ve miyeloid hastalığı ile ilişkili mutasyonların ve küçük moleküllerin kendi kendini yenileme ve HSPC'lerin farklılaşması.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deney için insan göbek kordon kanı Maricopa Entegre Sağlık Sistemleri (MIHS), Phoenix bilgilendirilmiş onayı sonra sağlıklı bireyler tarafından bağışlandı. Deidentified birimleri MIHS ve Arizona Üniversitesi arasında bir Malzeme Transfer Anlaşması ile elde edilmiştir.
1. Reaktifler ve Tamponlar
NOT: Tüm reaktifleri ve tamponları steril koşullar altında biyolojik bir güvenlik kabininde hazırlayın.
- Steril PBS-BSA-EDTA (PBE) tamponunu 7,2 mL steril %35 büyükbaş serum albumin (BSA; steril doku kültürü grade 35% BSA) ve 5 mL steril doku 0,5 M etilen diamin tetra asetik asit (EDTA) ilave ederek 487,8 mL steril Dulbecco'nun fosfat lı tampon tamponunu hazırlayın salin (DPBS). Filtre sterilize ve en az 2 h. Aliquot küçük hacimlerde gazdan arındırılmış tampon için biyolojik bir güvenlik kabininde vakum bağlı filtre bırakarak tampon sterilize ve gaz giderme ve 4 ° C'de saklayın.
- 1x Hanks dengeli tuz çözeltisi (1x HBSS) hazırlayın. 1 00 mL steril distile su 900 mL 1L 1x HBSS yapmak ve pH 7,2 pH ayarlamak için 100 mL 10x HBSS stok seyreltin. Filtre kullanmadan önce 1x HBSS sterilize.
- 98 mL distile suya 2 mL buzul asetik asit ekleyerek %2 asetik asit çözeltisi hazırlayın.
- 1x PBS'de 20 ng/mL rekombinant insan fibronektin parça çözeltisi hazırlayın. 48 kuyulu plaka başına 10 mL yapın.
- %2 BSA hazırlayın. 100 mL 1x PBS'ye, kullanmadan önce 2 gram BSA fraksiyonu V. Filtre sterilize edin.
- DMEM tozu, 3,7 gm sodyum bikarbonat, 100 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL penisilin-streptomisin (PS) ila 800 mL steril distile su ekleyerek Tam Dulbecco'nun Modifiye Kartal ortamını (DMEM) yapın. Hacmi 1 L'ye karıştırın ve makyaj yapın ve kullanmadan önce sterilize edin.
- 90 mL FBS ve 10 mL steril dimetil sülfoksit (DMSO) karıştırılarak donma ortamıhazırlayın.
- Stimülasyon ortamı nı hazırlayın. Serumsuz ortama, Kök hücre faktörü (SCF), trombopoietin (TPO) ve Fms benzeri tirozin kinaz 3 ligand (Flt3L) için 50 ng/mL'lik son konsantrasyona L-glutamin ve sitokinleri ekleyin (Interlökin-3 (IL3) için 20 ng/mL (Malzeme Tablosuna bakınız sitokin stok çözümlerinin hazırlanması için). 48 kuyulu plaka başına 5 mL yapın.
- 1x miyeloid farklılaşma ortamı hazırlayın. DMEM'i tamamlamak için SCF, Flt3L ve IL3 için 5 ng/mL, TPO için 50 ng/mL ve eritropoietin (EPO) için 4 birim/mL son konsantrasyonuna sitokin ekleyin. 48 kuyulu plaka başına 5 mL yapın.
- 2x miyeloid farklılaşma ortamı hazırlayın. DMEM'i tamamlamak için SCF, Flt3L ve IL3 için son konsantrasyon 10 ng/mL'ye sitokin, TPO için 100 ng/mL ve EPO için 8 birim/mL ekleyin. 48 kuyulu plaka başına 5 mL yapın.
- Akış sitometri tamponu hazırlayın. 1 X PBS'nin 1 L'sine 10 g BSA fraksiyonu V ekleyin.
- 1x PBS'de %1 paraformaldehit hazırlayın (ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın).
- 1x PBS'nin 49,5 mL'sine 500 mg/mL poli-L-l-l-lizin ekleyerek poli-L-lizin çözeltisini hazırlayın.
2. Mononükleer Hücrelerin Göbek KordonU Kanından İzolasyon
NOT: Aşağıda açıklanan protokol için 90-100 mL kordon kanı hacimleri kullanılmıştır. CD34+ hücrelerin izolasyonu biyolojik bir güvenlik kabininde steril koşullar altında yapılmalıdır.
- Biyolojik güvenlik kabinesine sokmadan önce dış yüzeyi sterilize etmek için UCB içeren torbayı %70 etanol ile püskürtün. UCB'yi steril 250 mL plastik şişeye aktarın ve eşit hacimde oda sıcaklığı (RT) 1x HBSS ekleyerek 1:1 seyreltin.
- Yaklaşık altı steril 50 mL konik tüpler içine tüp başına 15 mL MNC fraksiyonu ortamı (MFM; bkz. MalzemeTablosu) dağıtın. Tüpü MFM ile yatırın ve 30 mL seyreltilmiş UCB'yi rahatsız etmeden MFM katmanına hafifçe dökün.
- Tüpleri 400 x g'de 30 dk'da RT'de yavaş hızlanma ve fren olmadan santrifüj edin.
- Santrifüjden sonra, MNC tabakasının üzerinde plazmanın 15-20 mL arasında aspire edilmesi. MNC'leri bir pipetle yavaşça toplayın ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
NOT: MNC'ler plazma ve MFM arabiriminde beyaz buffy tabakası olarak birikinti, ve kırmızı kan hücreleri (RBC) konik tüpün altındaki tortu. - Havuz MNC'leri birlikte 2-3 tüpten toplanır. Soğuk PBE tamponu ile her tüpün hacmini 50 mL'ye kadar yapın.
- Tüpleri 300 x g'de 4 °C'de 10 dakika, freni düşük olan santrifüj edin.
- Supernatant aspirate ve hücre pelet gevşetmek için yavaşça tüp dokunun.
- 5 mL buz gibi pbe tamponundaki peletli hücreleri yeniden askıya alın. Diğer tüplerden hücreleri toplamak için aynı 5 mL yeniden askıya alınmış hücreleri kullanın. 3 ila 4 tüpteki hücreleri bir 50 mL konik tüpte birleştirin.
- Kalan hücreleri toplamak için, 5 mL soğuk PBE tampon ile tüm tüpleri yıkayın ve 50 mL konik tüp ekleyin.
- 10 μL hücre süspansiyonu 490 μL asetik asit çözeltisine seyrelterek MNC'leri sayın.
NOT: Asetik asit, MNC'lerin daha kolay sayılabilmesi için herhangi bir kirletici RBC'yi senkronize eder. - Buz gibi PBE tamponu ile hücre süspansiyonunun hacmini 50 mL'ye kadar yapın. Hücreleri 300 x g'de 4 °C'de 10 dakika, freni düşük olarak santrifüj edin.
NOT: MNC süspansiyon cd34 izolasyon için hemen işlenebilir+ hücreleri veya daha sonraki uygulamalar için dondurulmuş. - MNC'leri dondurmak için, süpernatant'ı çıkarın ve RT'de dondurucu ortamda 2 x 107 hücre/mL yoğunlukta yeniden askıya alın.
- Hücreleri bir hücre dondurma kabında geceleme -80 °C'de dondurun ve sıvı nitrojene aktarın.
3. CD34+ Hücrelerin Mononükleer Hücrelerden İzolasyon
- Taze yalıtılmış MNC'ler kullanıyorsanız doğrudan adım 3.3'e geçin.
- Dondurulmuş MNC kullanıyorsanız, 37 °C'lik bir su banyosunda dondurulmuş hücreleri hızlıbir şekilde eritin ve 50 mL konik bir tüpe aktarın. 1 mL buz gibi PBE tamponu ile şişelerde kalan hücreleri toplayın ve 50 mL konik tüpe aktarın.
- MNC süspansiyonun hacmini 50 mL'ye, soğuk PBE tamponu ve santrifüj ile 600 x g'de 4 °C'de 5 dk'ya kadar hazırlayın.
- Supernatant çıkarın ve hücre pelet gevşetmek için yavaşça tüp dokunun. 300 μL buz gibi PBE tamponunda MNC'leri 1 x 108 hücreye yeniden askıya alın.
- Manyetik aktive hücre sıralama (MACS) insan CD34 mikroboncuk kiti 1 x 108 MNCs başına 100 μL engelleme reaktifi ekleyin ve yavaşça karıştırın.
NOT: Bu, CD34 mikroboncuklarına nonspesifik bağlanmayı engeller. - 1 x 108 hücre başına 100 μL CD34 mikroboncuk ekleyin. Bir buzdolabında 30 dakika boyunca 4 °C'de hafifçe karıştırın ve kuluçkaya yatırın. Buzda kuluçkaya yatmayın.
- Hücreler kuluçkaya yatarken, MACS ayırıcı manyetik alanına bir LS sütunu ve ön ayırma filtresi yerleştirin. Kolona 2 mL doğrudan kolon ve ön ayırma filtresine 1 mL ekleyerek kolonu buz gibi PBE tamponuyla dengeleyin. Sütunun 15 mL konik bir tüpe boşalmasına ve akışı atmasına izin verin.
- MNC'leri 4 °C'den çıkarın, hacmi 15 mL'ye çıkarmak için buz gibi PBE tamponu ekleyin ve hücreleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve fren ilerde düşük olacak şekilde santrifüj edin.
- Supernatant aspire ve buz gibi PBE tampon 1 mL hücreleri yeniden askıya.
- Hücre süspansiyonuna LS sütununa yerleştirilen ön ayırma filtresine ekleyin.
NOT: Ön ayırma filtresi, sütunu engelleyebilecek büyük hücre agregalarını kaldırır. - Tüpü 3 mL buz gibi PBE tamponuyla durulayın ve LS sütununa yerleştirilen ön ayırma filtresine ekleyin. Bundan sonra, ön ayırma filtresini atın.
- 3 mL buz gibi PBE arabelleği ekleyerek LS sütunu dört kez yıkayın ve sütunun her seferinde boşalmasını bekleyin.
NOT: CD34+ hücreleri sütuna bağlı kalır ve etiketlenmemiş hücreler sütunboyunca akar. - Son yıkamadan sonra, kolonmacs ayırıcı manyetik alanından çıkarın ve mıknatıstan uzakta, 15 mL konik bir tüpe yerleştirin.
- Sütuna 5 mL buz gibi PBE tamponu ekleyin ve pistonda sıkıca iterek bağlı CD34+ hücreleri dışarı atın.
- İsteğe bağlı olarak, yukarıda açıklandığı gibi ön ayırma filtresi (3.10−3.13 adımları) ile ilk sütundan yalıtılmış CD34+ hücreleri başka bir LS sütunu üzerinden geçirin.
- Toplam canlı hücre sayısını belirlemek için izole EDILMIŞ CD34+ trypan mavisi (10 μL hücre ve 10 μL trypan mavisi) içeren hücreleri sayın.
NOT: Bu aşamada, izole CD34+ hücreler daha sonra kullanılmak üzere dondurulmuş olabilir veya akış sitometrisi (bölüm 4) veya miyeloid soy hücrelerine farklılaşma (bölüm 5) tarafından HSPCs analizi için doğrudan işlenebilir. - Hücre süspansiyonuna 600 x g'de RT'de 5 dakika, fren düşükken santrifüj edin.
- CD34+ hücreleri dondurmak için, supernatant aspire ve donma orta 1 mL 5 x 106 hücreleri kadar yeniden askıya ve yukarıda açıklandığı gibi dondurun (adım 2.13). Aksi takdirde, bölüm 4 veya 5'e devam edin.
4. Kök ve Ata Popülasyonlarının Akış Sitometrisi ile Belirlenmesi
- Yeni izole CD34+ HSPC'lerde kök ve progenitor popülasyonlarının fraksiyonlarını belirlemek için, 5 dk için 600 x g'de santrifüj edin ve 50 μL akış sitometri tamponunda 1 x 106 hücreyi yeniden askıya alın.
- 1 x 106 CD34+ hücrelere, soy belirteçlerine antikor (seyreltmeler için Malzemeler Tablosu'na bakınız) ekleyin (CD3, CD7, CD10, CD11b, CD19 ve CD235a — tüm FITC etiketli), CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD45RA (PE-Cy7), CD123 (APC) ve 7- aminoaktinomisin D (7-AAD; canlı/ölü bir leke olarak) ve toplam hacmi 100 μL'ye kadar yapar.
NOT: Analiz için 1 x 106 CD34+ 'dan az hücre kullanılabilir. Daha az hücre boyama ise, toplam hacmi ve eklenen antikorların hacmi buna göre azaltılmalıdır. Akış sitometrisi analizi için, lekesiz ve tek lekeli MNC'ler her florofor için pozitif ve negatif kapıları ayarlamak için kontrol olarak kullanılmalıdır. - Kuluçkadan sonra hücreleri 1 mL akış sitometri tamponu ve santrifüj ile 600 x g'da 5 dk yıkayın.
- İsteğe bağlı olarak, lekeli hücreleri 0,5 mL %1 paraformaldehit çözeltisi içinde 10 dakika boyunca karanlıkta RT'de düzeltin.
- 5 dk için 600 x g santrifüj ve supernatant aspire.
- Sabit/lekeli hücreleri 1 mL akış sitometri tamponu ve santrifüj ile 600 x g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca yıkayın.
- Süpernatant aspire, akış sitometri tampon 500 μL hücreleri yeniden askıya almak ve birakış sitometre (Malzeme Tablosu) ile analiz.
5. CD34+ Hematopoetik Kök ve Progenitor Hücrelerinmi Miyeloid Farklılaştırma
NOT: CD34+ HSPC'leri miyeloid soy hücrelerine ayırmak için, önce rekombinant insan fibronektin parçalı kaplı plakalar halinde uyarılır ve daha sonra miyeloid ayırım ortasında KIS-5 stromal hücrelerinin bir tabakası üzerinde tohumlanır. Dört miyeloid soya özgü hücre yüzeyi belirteçlerinin ekspresyonuna göre her hafta 3 hafta boyunca farklılaşma izlenebilir. Stimülasyon ve farklılaşma sırasında tüm kuluçkalar 37 °C'de ve %5 CO2 nemli bir odada yapılır. Tüm adımlar biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır.
- STERIL kaplamasız 48 kuyulu bir plakanın kuyularını, 1x PBS'de 2saat RT'ye 200 μL/kuyu rekombinant insan fibronektin çözeltisi ekleyerek kaplayın.
- 2 saat sonra, dikkatle rekombinant insan fibronektin çözeltisi çıkarın ve atın.
- RT'de 30 dakika boyunca %2 BSA'lık 200 μL/kuyu ile kuyuları kapatın.
- BSA çözeltisini aspire edin ve kuyuları 500 μL steril 1x PBS ile iki kez yıkayın.
NOT: Fibronectin parçalı kaplamalı plakalar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir. - CD34+ HSPC'leri uyarmak için, 1 x 105 hücre/200 μL veya 5 x 105 hücre/mL sıcak 1x stimülasyon ortamının yoğunluğunda yeni izole edilmiş hücreleri (adım 3.17'den) yeniden askıya alın.
- Dondurulmuş CD34+ hücreleri kullanıyorsanız, hızlı bir şekilde çözülür ve sıcak tam DMEM içeren 15 mL konik tüp hücreleri aktarın. 5 dk için 600 x g santrifüj ve adım 5.5 açıklandığı gibi hücreleri yeniden askıya.
- Plaka 200 μL CD34+ fibronektin parçası nın kuyu başına hücre süspansiyon 48-iyi plaka kaplı ve 48 saat kuluçka.
- Ertesi gün, tohum 15.000 MS-5 stromal hücreleri 200 μL tam DMEM kuyu başına 48-well doku kültürü tedavi plaka ve 24 saat için 37 °C'de kuluçka.
- 48 saat stimülasyondan sonra, CD34+ hücreleri nazik pipetleme ile toplayın. Kuyuları 500 μL ılık DMEM ile yıkayın ve hücre süspansiyonu ile havuzu.
- Trypan mavisi ile hücreleri sayın. Süspansiyonu 5 dk için 600 x g'da santrifüj edin ve 5.000 hücre/200 μL 1x miyeloid farklılaşma ortamı yoğunluğunda yeniden askıya alın.
- MS-5 stromal hücreleri ile tohumlu 48-iyi doku kültürü plaka itibaren, yavaşça hücreleri rahatsız etmeden orta aspire. Tabaka 200 μL (5.000 hücre) CD34+ hücre süspansiyon plaka ve 37 °C'de kuluçka başına.
NOT: MS-5 hücrelerinin kültürü tam DMEM'de muhafaza edilebilir. CD34+ hücrelerin tohumlu olduğu gün, MS-5 hücreleri tek tip bir tabakada olmalıdır (%80-90 biraraya). MS-5 hücrelerinin CD34+ hücrelerin tohumlamadan en az 24 saat önce kaplanması önerilir. MS-5 hücreleri CD34+ hücreleri tohumlamadan önce 48 saat veya 72 saat kaplanacaksa, hücre yoğunluğu buna göre ayarlanmalıdır. Ayrıca, kenar etkilerini önlemek için 48 kuyulu plakanın çevresel kuyularının boş bırakılması veya 200°L steril su ile doldurulması tavsiye edilir. - Her 3−4 günde bir yarım-orta değişimi her kuyunun üstünden hafifçe 100 μL'lik bir ortam çıkararak ve kuyu başına 100 μL 2x miyeloid farklılaşma ortamı ile değiştirerek gerçekleştirin.
- 21. günde, akış sitometrisi ile miyeloid soy belirteç ekspresyonunun analizi için hücreleri hasat edin. MS-5 tabakasını bozmadan, orta boruyu hafifçe pipetleyin ve hücreleri 5 mL'lik bir tüpe aktarın.
NOT: Boyama ve akış sitometrisi analizi için 1-2 kuyudan hücreler yeterlidir. Farklılaşma 1, 7 ve 14. Birden fazla günde immünhenotipoloji yapılacaksa, analiz için gerekli kuyu ların sayısı buna göre hesaplanmalıdır. - Leke 5 x 105 hücreleri CD34 (APC-Cy7), CD66b (PE-Cy7), CD14 (PE), CD41 (PerCP-Cy5.5) ve CD235a (APC) toplam hacmi 50 μL. 20 dakika boyunca karanlıkta buz üzerinde incubate. Ayarı için kontroller olarak lekesiz ve tek lekeli MNCs dahil her florofor için pozitif ve negatif kapılar, ve 7-AAD bir canlı / ölü leke olarak analiz ölü hücreleri ortadan kaldırmak için.
- Yukarıda açıklandığı gibi lekeli hücreleri yıkayın ve onarın (isteğe bağlı) (adım 4.3-4.6).
- Akış sitometri tamponunun 500 μL'lik hücrelerini yeniden askıya alın ve akış sitometre ile analiz edin.
6. Hücresel Morfolojinin Değerlendirilmesi
- Mikroskop slaytlarını etanol püskürterek ve gıcırdayana kadar silerek temizleyin.
- Temiz slaytları 5 dakika RT'de poli-L-lizin çözeltisine batırın ve RT'de 1 saat kurulayın.
- HSPC'leri adım 3.14'ten uzaklaştırın ve 10 μL akış sitometri tamponundaki 5.13.adımdan hücreleri ayırın.
- Hücre süspansiyonu kaplamalı slaytlara aktarın ve hava kurumaya bırakın.
NOT: 1. günden ve 21. - Slayta Wright-Giemsa lekesinin 0,5 mL'sini dökün ve RT'de 3 dakika bekletin.
- Eşit hacimli deiyonize su ekleyin ve RT'de 10 dakika daha bekletin.
- Deiyonize suda kaydırağı yıkayın.
- Lekeli hücreleri mikroskopla 60x veya 100x büyütme de görselleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokollerin uygulanması 5.6 (± 0.5) x 108 MNC ve 1 (± 0.3) x 106 CD34+ ~100 mL'lik bir kordon kan ünitesinden hücreler verir. Toplam CD34+ hücrelerin yüzdesi %80-90 arasında değişmektedir (Şekil2A,B). Manz ve ark.5 tarafından açıklanan şema tarafından immünopnotik analiz CD34+ hücreleri genellikle ~ 20% HSCs ve Lin olan ~ % 72 MPPs oluşur gösterir-/CD34+/ CD38- ve Lin-/ CD34+ /CD38+, sırasıyla (Şekil 1 ve Şekil 2A). MPP popülasyonunda CMP yüzdeleri (Lin-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA-), GMP'ler (Lin-/CD34+/CD38+/CD123lo/CD45RA+ ), ve MEP'ler (Lin-/CD34+/CD38+/CD123-/CD45RA-) sırasıyla %25, %15 ve %56'dır (Şekil 1 ve Şekil 2B).
Miyeloid farklılaşma koşullarında izole HSPC'lerin kuluçka sırasında CD34 belirteci progresif kaybı vardır. İmmünofetamin, CD34+ hücrelerinin yüzdesinin izolasyonda ~%90'dan (Şekil2A) 21.günde ~%23'e kadar azaldığına (Şekil3B) gösterir. CD34 analizi- nüfus olgun miyeloid soy belirteçleri ifade hücrelerin in yüzdesi eşlik eden bir artış göstermektedir. Monositler için belirteçleri ifade eden hücrelerin yüzdesinde bir artış vardır (CD34-/CD14+/CD66b-) ortalama %1,7 ile %12 arasında, granülositler için (CD34-/CD14-/CD66b+) için %1,3'ten %5,3'e megakaryositler (CD34-/CD41+/CD235a-) %1,8'den %8'e ve eritroit hücreler için (CD34-/CD41-/CD235a+ )%0,7'den %11'e (Şekil3C). Wright-Giemsa lekeli hücrelerin incelenmesi, hücrelerin 1. Farklılaşmamış hücreler büyük yuvarlak çekirdeklere ve çok az sitoplazmaya sahiptir. Diğer taraftan, farklılaşmış kültürlerden hücreler olgun monositler, granülositler ve eritrositler gibisoy hücrelerinin özelliklerini sergilerler (Şekil 4). Böylece, bu protokolde açıklanan kültür koşulları UCB CD34+ hücrelerin miyeloid soy hücrelerine farklılaşmasını teşvik etmektedir.
Şekil 1 : Hematopoetik farklılaşma şeması. Pluripotent hematopoetik kök hücre (HSC), yaygın miyeloid ata (CMP) ve yaygın lenfoid progenitor (CLP) hücrelerine yol açan çok güçlü ataya (MPP) ayrılır. CmP'ler diğer iki miyeloid ataip, granülosit monosit ataları (GDP) ve megakaryosit eritrosit ataları (MEP) oluştururlar. Granülositler ve monositler GDO'lardan, eritrositler ve megakaryositler meps ortaya çıkar. ClPs doğal öldürücü yol açar, B, ve T hücreleri. Bu protokoldeki hücre popülasyonlarını karakterize etmek için kullanılan hücre yüzey idikatörleri belirtilir. Bu rakam Bapat ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2 : Hematopoetik kök ve ata hücrelerinin immünobünotibik analizi. (A) Hücreler, tek bir hücre popülasyonu seçmek için ileri ve yan dağılımda geçitli olarak vesvetildi. Cd3, CD7, CD10, CD11b, CD19 ve CD235a (tüm FITC lekeli) 7-AAD ve antikorlar ile boyama ile ölü ve soy pozitif hücreleri ortadan kaldırıldı. Lin-/live hücreleri CD34 (APC-Cy7), CD38 (PE), CD123 (APC) ve CD45RA (PE-Cy7) antikorları ile analiz edildi. Progenitorlar CD34+/CD38+ hücrelerden ayırt edildi. CMPs CD123lo/ CD45RAvardır-, GMPs CD123lo/ CD45RA+ ve MEPs CD123vardır -/ CD45RA-. Bir denemedeki temsili dağılım çizimleri gösterilir. (B) Kordon kanında toplam HSP'lerin (toplam CD34+ hücre), CmP'lerin, GDO'ların ve MEP'lerin yüzdeleri temsil edilir. Sunulan veriler, en az üç bağımsız denemeden standart hata içeren ortalamalardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3 : Miyeloid soy hücrelerinin immünopnotibik analizi. Tek hücreler ileri ve yan dağılıma göre geçitli idi. CD34- hücreler CD34 (APC-Cy7) antikor ile boyama tarafından seçildi. CD34'teki miyeloid soylar- popülasyon, CD14 (PE), CD66b (PE-Cy7), CD41 (PerCP-Cy5.5) ve CD235a (APC) gün 1 (A) ve21. Monositler CD14+/CD66b-, granülositler CD14vardır -/CD66b+, megakaryositler CD41+/ CD235avardır - ve eritroit hücreleri CD41 vardır-/CD235a +. Bir denemedeki temsili dağılım çizimleri gösterilir. CD34'teki monosit, granülosit, megakaryosit ve eritroid hücrelerin fraksiyonları temsil edilir- 1. Sunulan veriler, en az üç bağımsız denemeden standart hata içeren ortalamalardır. Bu rakam Bapat ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4 : HSPC'lerin ve farklılaşmış hücrelerin temsili görüntüleri. CD34+ HSPCs (A) ve gün 21 miyeloid kültürlerden hücreler (B) Wright-Giemsa leke ile lekelendi. Granülositlere karşılık gelen hücreler (siyah oklar), monositler (mavi oklar) ve eritroid hücreler (kırmızı oklar) gösterilir. Ölçek çubukları 10 mm'yi temsil ediyor. Bu rakam Bapat ve ark.11'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, UCB'den türetilen CD34+ HSPC'lerin dört miyeloid soya ex vivo farklılaşması için uygundur. SCF, TPO, Flt3L ve IL3'ten oluşan bir sitokin karışımı ile ilk kuluçka CD34+ hücreleri uyarır. Daha sonra, farklılaşma SCF, IL3, Flt3L, EPO ve TPO bir kokteyl ile elde edilir. Bu karışımda, SCF, IL3 ve Flt3L CD34+ HSCs hayatta kalma ve çoğalması için önemlidir. EPO ve TPO eritrositler ve megakaryositler doğru farklılaşma teşvik, sırasıyla, ve IL3 erken granülosit-monosit farklılaşmasıteşvik öncüleri ve olgun hücreler13,17,18. Bu yönteme bir uyarı farklılaşmış hücrelerin yüzdelerinde gözlenen varyasyon olduğunu. Bu cd34 kapasiteleri farklılıklar nedeniyle olabilir+ HSPCs farklı donörlerden izole soy hücrelerine yol vermek için.
MS-5 hücrelerinin katmanı CD34+ HSPCs verimli farklılaşması için önemlidir. Deneyimlerimize göre, MS-5 hücrelerinin CD34+ hücrelerin tohumlamadan en az 24 saat önce kaplanması gerekir. MS-5 hücrelerinin birleşmesi %80-90'da muhafaza etmek önemlidir. Aşırı konkordato MS-5 hücreleri kopma eğilimindedir, ve daha düşük bir araya gelmesi azaltılmış farklılaşmaya neden olur. Kuluçka sırasında, CD34+ hücreleri ~ 50 kat genişletin. Onlar gün 14 confluent olur ve hasat edilmesi ve yeni bir plaka üzerinde MS-5 hücreleri içeren ek kuyular bölünmüş gerekir.
Ortam değişikliklerinin sıklığı da verimli farklılaşma için önemlidir ve optimum sitokin konsantrasyonlarını korumak için her 3-4 günde bir yapılmalıdır. Daha az ortam değişikliği ve daha düşük sitokin konsantrasyonları, her ikisi de cd34+ HSPCs proliferasyon ve farklılaşma bir azalmaya neden olur. Büyük miktarda sitokin için bu gereksinim maliyetleri önemli ölçüde artırabilir ve bu nedenle, bu protokolün bir sınırlamadır. Büyük ölçekli deneyler için başka bir sınırlama CD34+ hücrelerin bir birim kordon kanı elde edilen sayısıdır. Tipik olarak, ~ 100 mL taze bir UCB birimi yaklaşık bir milyon CD34+ hücreleri verir. Ünitenin 24 saatten fazla saklanması verimi önemli ölçüde azaltır. CD34+ hücrelerin saflık daha fazla kaybı herhangi bir etiketlenmemiş kirletici hücreleri kaldırmak için önemli olan sütun yıkama adımları sırasında oluşabilir. Sütun yıkama adımları sırasında tıkanırsa, cd34+ hücrelerin saf bir popülasyon elde etmek için tıkanmış sütundan bağlı hücrelerin eluted ve yeni bir sütun üzerinde yeniden yüklenmesi önerilir.
Literatürde, farklı sitokin kombinasyonları ya megakaryositik, eritroid, ya da granülo-monositsoy19,20,21,22 karşı farklılaşma teşvik bildirilmiştir . Bu protokolün bir avantajı, dört miyeloid popülasyonda, yani monositler, granülositler, megakaryositler ve eritrositler boyunca farklılaşmaya olanak sağlamasıdır. Böylece, normal miyeloid farklılaşmayı incelemek ve miyeloid hastalığın (miyelodisplastik sendromlar, akut miyeloid lösemi, miyeloproliferatif neoplazmlar ve diğerleri) ilişkili nokta mutasyonlarının ve cd34+ hücrelerin 11,12,23,24,25proliferasyonu ve farklılaşması sırasında moleküler ve hücresel fenotip üzerinde kromozom translokasyonları . Bu protokol aynı zamanda anti-ve pro-inflamatuar sitokinlerin etkisini incelemek için istihdam edilebilir, ve miyeloid farklılaşma potansiyel terapötik ilaçların26,27,28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar Wendy Barrett, Rachel Caballero ve Gabriella Ruiz Maricopa Entegre Sağlık Sistemleri de-tespit ve bağışlanan kordon kan birimleri için, Mrinalini Kala akış sitometri ile yardım için teşekkür etmek istiyorum ve Gay Crooks ve Christopher Seet için ex vivo miyeloid farklılaşma tavsiye. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R21CA170786 ve R01GM127464) ve Amerikan Kanser Derneği (Kurumsal Araştırma Hibe 74-001-34-IRG) S.S. fonları ile desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% Trypan blue solution | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | Dilute working stock to 0.2% in sterile 1x PBS |
| 0.5 M UltraPure Ethylene diamine tetra acetic acid, pH 8.0 | Gibco | 15575-038 | |
| 10x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Invitrogen | 14185052 | Dilute to 1x with sterile distilled water & pH to 7.2 |
| 2.5% Trypsin, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 15090046 | Dilute working stock to 1x with sterile 1x PBS |
| 30 µm Pre-separation filters | Miltenyi biotech | 130-041-407 | |
| 35% sterile Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7979 | |
| 7-AAD | Biolegend | 420404 | Used as a live/dead stain to eliminate dead cells from FACS analysis |
| Anti-human CD10-FITC antibody (Clone HI10a) | Biolegend | 312207 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD11b-FITC (activated) antibody (Clone CBRM1/5) | Biolegend | 301403 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD123-APC antibody (Clone 6H6) | Biolegend | 306012 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD14-PE antibody (Clone M5E2) | Biolegend | 301806 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD19-FITC antibody (Clone 4G7) | BD Biosciences | 347543 | Use 1:5 dilution |
| Anti-human CD235a-APC antibody (Clone GA-R2 (HIR2)) | BD Biosciences | 551336 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD235a-FITC antibody (Clone HIR2) | Biolegend | 306609 | Use 1:50 dilution |
| Anti-human CD34-APC-Cy7 antibody (Clone 581) | Biolegend | 343514 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD38-PE antibody (Clone HIT2) | Biolegend | 303506 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD3-FITC antibody (Clone UCHT1) | Biolegend | 300405 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD41a-PerCP-Cy5.5 antibody (Clone HIP8) | Biolegend | 303720 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD45Ra-PE-Cy7 antibody (Clone HI100) | Biolegend | 304126 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD66b-PE-Cy7 antibody (Clone G10F5) | Biolegend | 305116 | Use 1:20 dilution |
| Anti-human CD7-FITC antibody (Clone CD7-6B7) | Biolegend | 343103 | Use 1:20 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Filter sterilize before use |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) powder with L-Glutamine | Gibco | 12100046 | Reconstitute 1 packet to make 1 L of DMEM media with sodium bicarbonate, 10% FBS & 1% penicillin & streptomycin |
| Fetal bovine serum, Australian source, heat inactivated | Omega Scientific | FB-22 Lot #609716 | |
| Human CD34 microbead kit | Miltenyi biotech | 130-046-702 | |
| Human Thrombopoietin (TPO), research grade | Miltenyi biotech | 130-094-011 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 50 ng/mL for both myeloid differentiation & stimulation medium |
| L-Glutamine | Omega Scientific | GS-60 | 2 mM concentration in stimulation medium |
| LS Columns | Miltenyi biotech | 130-042-401 | |
| MACS Multi stand | Miltenyi biotech | 130-042-303 | |
| MidiMACS magnetic separator | Miltenyi biotech | 130-042-302 | |
| MNC fractionation media (Ficol-Paque PLUS) | GE Healthcare Biosciences | 17-1440-03 | |
| MS-5 cells | Gift from the laboratory of Gay Crooks, UCLA | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Heat 800 mL of 1x PBS in a glass beaker on a stir plate in a chemical hood to ~65 °C. Add 10 g of paraformaldehyde powder. To completely dissolve the paraformaldehyde, raise the pH by adding 1 N NaOH. Cool and filter the solution and make up the volume to 1 L with 1x PBS. Adjust the pH to 7.2. |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ml | |
| Poly-L lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | Make a 10 mg/mL stock in 1x PBS |
| Recombinant human erythropoietin-alpha (rHu EPO-α) | BioBasic | RC213-15 | Make a stock of 2,000 units/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 4 units/mL for myeloid differentiation |
| Recombinant human fibronectin fragment (RetroNectin) | Takara | T100B | Use 20 µg/mL diluted in sterile 1x PBS to coat wells prior to stimulation of CD34+ HSCs. |
| Recombinant human Flt-3 ligand (rHu Flt-3L) | BioBasic | RC214-16 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human interleukin-3 (rHu IL-3) | BioBasic | RC212-14 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 20 ng/mL in stimulation medium |
| Recombinant human stem cell factor (rHu SCF) | BioBasic | RC213-12 | Make a stock of 100 µg/mL in 1x PBS + 0.1% BSA. Use 5 ng/mL for myeloid differentiation & 50 ng/mL in stimulation medium |
| Serum free medium (X-Vivo-15) | Lonza | 04-418Q | |
| Sodium bicarbonate | Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Wright-Giemsa stain, modified | Sigma-Aldrich | WG16-500 | Use according to manufacturer's instructions |
| Equipment | |||
| BD LSR II flow cytometer | BD Biosciences | ||
| Centrifuge | Sorvall Legend RT | ||
| Light microscope | Olympus |
References
- Hao, Q. L., Shah, A. J., Thiemann, F. T., Smogorzewska, E. M., Crooks, G. M. A functional comparison of CD34 + CD38- cells in cord blood and bone marrow. Blood. 86 (10), 3745-3753 (1995).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (18), 11872-11877 (2002).
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91 (5), 661-672 (1997).
- Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 2 (6), 640-653 (2010).
- Haas, S., et al. Inflammation-Induced Emergency Megakaryopoiesis Driven by Hematopoietic Stem Cell-like Megakaryocyte Progenitors. Cell Stem Cell. 17 (4), 422-434 (2015).
- Sanjuan-Pla, A., et al. Platelet-biased stem cells reside at the apex of the haematopoietic stem-cell hierarchy. Nature. 502 (7470), 232-236 (2013).
- Bender, J. G., et al. Phenotypic analysis and characterization of CD34+ cells from normal human bone marrow, cord blood, peripheral blood, and mobilized peripheral blood from patients undergoing autologous stem cell transplantation. Clinical Immunology and Immunopathology. 70 (1), 10-18 (1994).
- Fritsch, G., et al. The composition of CD34 subpopulations differs between bone marrow, blood and cord blood. Bone Marrow Transplantation. 17 (2), 169-178 (1996).
- Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem Cells. 13 (2), 158-166 (1995).
- Hordyjewska, A., Popiolek, L., Horecka, A. Characteristics of hematopoietic stem cells of umbilical cord blood. Cytotechnology. 67 (3), 387-396 (2015).
- Bapat, A., et al. Myeloid Disease Mutations of Splicing Factor SRSF2 Cause G2-M Arrest and Skewed Differentiation of Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. Stem Cells. 36, 1-13 (2018).
- Yip, B. H., et al. The U2AF1S34F mutation induces lineage-specific splicing alterations in myelodysplastic syndromes. Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2206-2221 (2017).
- Yoo, E. S., et al. Myeloid differentiation of human cord blood CD34+ cells during ex vivo expansion using thrombopoietin, flt3-ligand and/or granulocyte-colony stimulating factor. British Journal of Haematology. 105 (4), 1034-1040 (1999).
- Hao, Q. L., Smogorzewska, E. M., Barsky, L. W., Crooks, G. M. In vitro identification of single CD34+CD38- cells with both lymphoid and myeloid potential. Blood. 91 (11), 4145-4151 (1998).
- Moretta, F., et al. The generation of human innate lymphoid cells is influenced by the source of hematopoietic stem cells and by the use of G-CSF. European Journal of Immunology. 46 (5), 1271-1278 (2016).
- Sanz, E., et al. Ordering human CD34+CD10-CD19+ pre/pro-B-cell and CD19- common lymphoid progenitor stages in two pro-B-cell development pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5925-5930 (2010).
- Egeland, T., et al. Myeloid differentiation of purified CD34+ cells after stimulation with recombinant human granulocyte-monocyte colony-stimulating factor (CSF), granulocyte-CSF, and interleukin-3. Blood. 78 (12), 3192-3199 (1991).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81 (11), 2844-2853 (1993).
- Perdomo, J., Yan, F., Leung, H. H. L., Chong, B. H. Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56420 (2017).
- Palii, C. G., Pasha, R., Brand, M. Lentiviral-mediated knockdown during ex vivo erythropoiesis of human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (53), e2813 (2011).
- Davies, C., et al. Silencing of ASXL1 impairs the granulomonocytic lineage potential of human CD34(+) progenitor cells. British Journal of Haematology. 160 (6), 842-850 (2013).
- Caceres, G., et al. TP53 suppression promotes erythropoiesis in del(5q) MDS, suggesting a targeted therapeutic strategy in lenalidomide-resistant patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16127-16132 (2013).
- Shi, H., et al. ASXL1 plays an important role in erythropoiesis. Scientific Reports. 6, 28789 (2016).
- Mazumdar, C., et al. Leukemia-Associated Cohesin Mutants Dominantly Enforce Stem Cell Programs and Impair Human Hematopoietic Progenitor Differentiation. Cell Stem Cell. 17 (6), 675-688 (2015).
- Chung, K. Y., et al. Enforced expression of an Flt3 internal tandem duplication in human CD34+ cells confers properties of self-renewal and enhanced erythropoiesis. Blood. 105 (1), 77-84 (2005).
- Ambrosini, P., et al. IL-1beta inhibits ILC3 while favoring NK-cell maturation of umbilical cord blood CD34(+) precursors. European Journal of Immunology. 45 (7), 2061-2071 (2015).
- Batard, P., et al. TGF-(beta)1 maintains hematopoietic immaturity by a reversible negative control of cell cycle and induces CD34 antigen up-modulation. Journal of Cell Science. 113, Pt 3 383-390 (2000).
- Huang, N., Lou, M., Liu, H., Avila, C., Ma, Y. Identification of a potent small molecule capable of regulating polyploidization, megakaryocyte maturation, and platelet production. Journal of Hematology & Oncology. 9 (1), 136 (2016).
