In vivo avbildning och kvantifiering av värdens angiogena respons i Zebrafish Tumörxenografts
Summary
Syftet med denna metod är att generera en in vivo modell av tumör angiogenes av xenografting däggdjurs tumörceller till en zebrafiskar embryo som har fluorescently-märkta blodkärl. Genom avbildning av xenograft och tillhörande kärl kan en kvantitativ mätning av angiogena svar erhållas.
Abstract
Tumör angiogenes är ett centralt mål för anti-cancerterapi och denna metod har utvecklats för att ge en ny modell för att studera denna process in vivo. En zebrafiskar xenograft skapas genom att implantera däggdjurs tumörceller i perivitelline utrymme för två dagar-efter befruktning zebrafiskar embryon, följt av att mäta omfattningen av angiogena svaret observerades vid en experimentell Endpoint upp till två dagar efter implantation. Den viktigaste fördelen med denna metod är förmågan att exakt kvantifiera zebrafiskar värd angiogena svar på transplantatet. Detta möjliggör detaljerad undersökning av de molekylära mekanismerna samt värd vs tumör bidrag till angiogena svaret. De xenotransplanterade embryona kan utsättas för en mängd olika behandlingar, såsom inkubering med potentiella antiangiogeneshämmande läkemedel, för att undersöka strategier för att hämma tumör angiogenes. Den angiogena svaret kan också vara Live-avbildas för att undersöka mer dynamiska cellulära processer. Den relativt krävande experimentell teknik, billiga underhållskostnader av zebrafisk och korta experimentella tidslinjen gör denna modell särskilt användbart för utveckling av strategier för att manipulera tumör angiogenes.
Introduction
Angiogenes är en av de klassiska kännetecknen för cancer och representerar ett mål för anti-cancerterapi1,2. För att studera denna process, xenograft modeller av cancer har skapats genom att implantera däggdjurs tumörceller till djur som möss3. En zebrafiskar xenograft-modell har också utvecklats, vilket innebär implantation av tumörceller i 2 dagar efter befruktning (dpi) zebrafiskar vilket resulterar i snabb tillväxt av zebrafiskar blodkärl i xenograft4.
Detta protokoll beskriver en in vivo zebrafiskar embryo tumör xenograft modell där angiogena svaret kan kvantifieras exakt över hela xenograft. Denna metod gör det möjligt för prövaren att undersöka, in vivo, de molekylära mekanismerna som förstärker tumörangiogena svar. Den genetiska tractabilitet av zebrafiskar låter värd bidraget att förhöras, medan valet av olika tumör cellinjer tillåter tumörens bidrag till angiogenes också undersökas5,6,7. Dessutom, som zebrafiskar larver är permeabla för små molekyler, specifika väg hämmare kan användas eller läkemedelsbibliotek kan screenas för att identifiera nya hämmare av tumör angiogenes8,9,10, 11.
Zebrafiskar embryo xenograft-modellen ger unika fördelar jämfört med andra modeller av xenograft från däggdjur. Zebrafish xenograft är billigare och lättare att utföra, ett stort antal djur kan undersökas och levande cell avbildning möjliggör detaljerad undersökning av cell beteende4. Till skillnad från andra in vivo-modeller, som kräver upp till flera veckor för att iaktta signifikant fartygs tillväxt, kan angiogenes i zebrafiskar xenografter observeras inom 24 timmar efter implantation3,4. Men avsaknaden av ett adaptivt immunförsvar i embryonal zebrafisk, samtidigt fördelaktigt att upprätthålla xenograft, innebär att den adaptiva immunförsvaret och dess bidrag till tumör angiogenes inte kan undersökas. Dessutom, avsaknaden av tumör stromaceller, oförmåga att ortotopiskt implantat tumören och skillnaden i underhålls temperatur mellan zebrafiskar och däggdjursceller är potentiella svagheter i denna metod. Icke desto mindre, möjligheten att denna modell för levande avbildning och förmågan att exakt kvantifiera angiogena svaret gör det unikt fördelaktigt för att studera de cellulära processer som reglerar tumör angiogenes in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det första kritiska steget i protokollet är implantation av tumörceller. Det är viktigt att celler injiceras i en plats som gör det möjligt för xenograft att implantatet framgångsrikt i embryot utan att göra embryot edematous. En injektion som är för anterior kan tillåta cellerna att röra sig mot hjärtat, blockerar blodomloppet och leder till ödem, medan en injektion som är för posterior kommer att resultera i en dåligt implanterade xenograft. En främre injektion är bäst undvikas genom att sätta in …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Mr alhad mahagaonkar för att förvalta universitetet i Auckland zebrafiskar Facility och biomedicinsk avbildning enheten, School of Medical Sciences, University of Auckland, för stöd i tidsförlopp konfokal mikroskopi. Detta arbete stöddes av ett hälso forskningsråd i Nya Zeeland projekt Grant (14/105), ett kungligt sällskap av nya Zeeland Marsden fonden projekt Grant (UOA1602) och en Auckland Medical Research Foundation projekt Grant (1116012) tilldelas J.W.A.
Materials
| Air cylinder | BOC | 011G | Xenotransplantation |
| B16-F1 cells | ATCC | Cell culture | |
| BD Matrigel LDEV-free (extracellular matrix mixture) | Corning | 356235 | Xenotransplantation |
| Borosillicate glass capillaries | Warner Instruments | G100T-4 | OD=1.00 mm, ID=0.78 mm, Length =10 cm Cell injection |
| Cell culture dish -35 mm diameter | Thermofisher NZ | NUN153066 | Fish husbandry |
| Cell culture dish -100 mm diameter | Sigma-Aldrich | CLS430167-500EA | Fish husbandry |
| Cell culture flask 75 cm2 | In Vitro Technologies | COR430641 | Cell culture |
| CellTracker Green | Invitrogen | C2925 | Cell labelling, Stock concentration (10 mM in DMSO), working concentration (0.2 μM in serum-free media) |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | Drug treatment, Cell labelling |
| E3 Media (60x in 2 L of water) 34.8 g NaCl 1.6 g KCl 5.8 g CaCl2·2H2O 9.78 g MgCl2·6H2O adjust to pH 7.2 with NaOH |
In house [1] | Fish husbandry | |
| Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | Xenotransplantation, Imaging |
| Filter tip 1000 μL | VWR | 732-1491 | Used during multiple steps |
| Filter tip 200 μL | VWR | 732-1489 | Used during multiple steps |
| Filter tip 10 μL | VWR | 732-1487 | Used during multiple steps |
| Fluorescence microscope | Leica | MZ16FA | Preparation of embryos |
| FBS (NZ origin) | Thermofisher Scientific | 10091148 | Cell culture |
| Gloves | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Haemocytometer cell counting chamber Improved Neubauer | HawksleyVet | AC1000 | Xenotransplantation |
| Heraeus Multifuge X3R Centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004500 | Cell culture, Cell labelling |
| Hoechst 33342 | Thermofisher Scientific | 62249 | Cell labelling, Stock concentration (1 mg/ml in DMSO), working concentration (6 μg/ml in serum-free media) |
| Low Melting Point, UltraPure Agarose | Thermofisher Scientific | 16520050 | Imaging |
| Methycellulose | Sigma-Aldrich | 9004 67 5 | Xenotransplantation |
| Methylene blue | sigma-Aldrich | M9140 | Fish husbandry |
| Microloader 0.5-20 μL pipette tip for loading microcapillaries | Eppendorf | 5242956003 | Xenotransplantation |
| Micropipettes | Any commercial brand | Used during multiple steps | |
| Micropipette puller P 87 | Sutter Instruments | Xenotransplantation | |
| Microscope cage incubator | Okolab | Time-lapse imaging | |
| Microwave | Any commercial brand | Imaging | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M3516 | Xenotransplantation |
| Minimal Essential Media (MEM) – alpha | Thermofisher Scientfic | 12561056 | Cell Culture |
| MPPI-2 Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | Xenotransplantation | |
| Narishige micromanipulator | Narishige Group | Xenotransplantation | |
| Nikon D Eclipse C1 Confocal Microscope | Nikon | Imaging | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | Fish husbandry |
| PBS | Gibco | 10010023 | Cell culture |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Cell culture |
| S1 pipet filler | Thermoscientific | 9501 | Cell culture |
| Serological stripette 10 mL | Corning | 4488 | Cell culture |
| Serological stripette 25 mL | Corning | 4489 | Cell culture |
| Serological stripette 5 mL | Corning | 4485 | Cell culture |
| Serological stripette 2 mL | Corning | 4486 | Cell culture |
| Terumo Needle 22 gauge | Amtech | SH 182 | Fish husbandry |
| Tissue culture incubator | Thermofisher Scientfic | HeraCell 150i | Cell culture |
| Tivozanib (AV951) | AVEO Pharmaceuticals | Drug treatment | |
| Transfer pipette 3 mL | Mediray | RL200C | Fish husbandry |
| Trypsin/EDTA (0.25% ) | Life Technologies | T4049 | Cell culture |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11295-10 | Fish husbandry |
| Volocity Software (v6.3) | Improvision/Perkin Elmer | Image analysis |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Huang, D., et al. Sunitinib acts primarily on tumor endothelium rather than tumor cells to inhibit the growth of renal cell carcinoma. Ricerca sul cancro. 70 (3), 1053-1062 (2010).
- Ribatti, D. . Tumor Angiogenesis Assays. , (2016).
- Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Ricerca sul cancro. 67 (7), 2927-2931 (2007).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. Journal of Pathology. 227 (4), 431-445 (2012).
- Ablain, J., Durand, E. M., Yang, S., Zhou, Y., Zon, L. I. A CRISPR/Cas9 vector system for tissue-specific gene disruption in zebrafish. Developmental Cell. 32 (6), 756-764 (2015).
- Astin, J. W., et al. Vegfd can compensate for loss of Vegfc in zebrafish facial lymphatic sprouting. Development. 141 (13), 2680-2690 (2014).
- Yang, J. H., Hu, J., Wan, L., Chen, L. J. Barbigerone inhibits tumor angiogenesis, growth and metastasis in melanoma. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (1), 167-174 (2014).
- Zhang, S., et al. SKLB1002, a novel potent inhibitor of VEGF receptor 2 signaling, inhibits angiogenesis and tumor growth in vivo. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4439-4450 (2011).
- Muthukumarasamy, K. M., et al. Identification of noreremophilane-based inhibitors of angiogenesis using zebrafish assays. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (5), 1569-1578 (2016).
- Britto, D. D., et al. Macrophages enhance Vegfa-driven angiogenesis in an embryonic zebrafish tumor xenograft model. Disease Models & Mechanisms. 11 (12), (2018).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nature Protocols. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Huang, H., Zhang, B., Hartenstein, P. A., Chen, J. N., Lin, S. NXT2 is required for embryonic heart development in zebrafish. BMC Developmental Biology. 5, 7 (2005).
- Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Biologia dello sviluppo. 248 (2), 307-318 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), (2012).
- Fior, R., et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), E8234-E8243 (2017).
- Eng, T. C. Y., Astin, J. W. Characterization of Zebrafish Facial Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 71-83 (2018).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Nakamura, K., et al. KRN951, a highly potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, has antitumor activities and affects functional vascular properties. Ricerca sul cancro. 66 (18), 9134-9142 (2006).
- Okuda, K. S., et al. A zebrafish model of inflammatory lymphangiogenesis. Biology Open. 4 (10), 1270-1280 (2015).
- Steinberg, F., Konerding, M. A., Streffer, C. The vascular architecture of human xenotransplanted tumors: histological, morphometrical, and ultrastructural studies. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 116 (5), 517-524 (1990).
- Vermeulen, P. B., et al. Microvessel quantification in primary colorectal carcinoma: an immunohistochemical study. British Journal of Cancer. 71 (2), 340-343 (1995).
- Heilmann, S., et al. A Quantitative System for Studying Metastasis Using Transparent Zebrafish. Ricerca sul cancro. 75 (20), 4272-4282 (2015).
- Okuda, K. S., Lee, H. M., Velaithan, V., Ng, M. F., Patel, V. Utilizing Zebrafish to Identify Anti-(Lymph)Angiogenic Compounds for Cancer Treatment: Promise and Future Challenges. Microcirculation. 23 (6), 389-405 (2016).
- Zhao, C., et al. Endothelial Cords Promote Tumor Initial Growth prior to Vascular Function through a Paracrine Mechanism. Scientific Reports. 6, 19404 (2016).
- Goel, S., Wong, A. H., Jain, R. K. Vascular normalization as a therapeutic strategy for malignant and nonmalignant disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (3), a006486 (2012).
- Schmitt, C. E., Holland, M. B., Jin, S. W. Visualizing vascular networks in zebrafish: an introduction to microangiography. Methods in Molecular Biology. , 59-67 (2012).
