कैस9 प्रोटीन-GRNA परिसरों के इलेक्ट्रोपोरेशन के माध्यम से एक्सोटोटल स्पाइनल कॉर्ड न्यूरल स्टेम सेल का डायरेक्ट जीन नॉक-आउट
Summary
यहाँ प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है समय और अंतरिक्ष प्रतिबंधित जीन दस्तक प्रदर्शन करने के लिए axolotl रीढ़ की हड्डी में CAS9-GRNA परिसर रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में इंजेक्शन द्वारा जिसके बाद electroporation.
Abstract
एक्सोटोल में अपनी रीढ़ की हड्डी को पूरी तरह से पुनर्जीवित करने की अद्वितीय क्षमता है। यह काफी हद तक जीवन भर तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के रूप में शेष ependymal कोशिकाओं के कारण है, जो ependymal ट्यूब में सुधार और रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद खो न्यूरॉन्स में अंतर करने के लिए proliferate. Deciphering कैसे इन NSCs pluripotency के बाद विकास को बनाए रखने और रीढ़ की हड्डी की चोट पर proliferate सटीक पूर्व चोट संरचना में सुधार कैसे स्तनधारी रीढ़ की हड्डी के रूप में अच्छी तरह से संभावित उपचार के विकल्प पुनर्जीवित कर सकते हैं में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. एक प्रतिबंधित समय अवधि के भीतर एनएससी के विशिष्ट सबसेट में जीन नॉक-आउट प्रदर्शन विकास परेशान प्रभाव से उलझन में होने के बिना, इन पुनर्योजी प्रक्रियाओं के पीछे आणविक तंत्र के अध्ययन की अनुमति देगा। यहाँ वर्णित CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर axolotl रीढ़ की हड्डी NSCs में जीन नॉक आउट प्रदर्शन करने के लिए एक विधि है। इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद रीढ़ की हड्डी केंद्रीय नहर में CAS9-GRNA परिसर इंजेक्शन द्वारा, लक्ष्य जीन एक वांछित समय बिंदु पर रीढ़ की हड्डी के विशिष्ट क्षेत्रों के भीतर एनएससी में बाहर खटखटाया जाता है, रीढ़ की हड्डी NSCs के आणविक अध्ययन के लिए अनुमति के दौरान पुनर्जनन.
Introduction
अधिकांश कशेरुकियों की रीढ़ की हड्डी चोट के बाद पुनर्जीवित करने में असमर्थ है, जिससे स्थायी विकलांगता हो जाती है। इस तरह के एक्सोलोटल के रूप में कई salamanders, उल्लेखनीय अपवाद हैं. axolotl पूरी तरह से एक संरचनात्मक समान रीढ़ की हड्डी को पुनर्जीवित कर सकते हैं और पूरी तरह से रीढ़ की हड्डी समारोह बहाल. एक्स्ओटॉल रीढ़ की हड्डी की पुनर्योजी क्षमता का अधिकांश हिस्सा एपेंडिमल कोशिकाओं के कारण होता है। इन कोशिकाओं को केंद्रीय नहर लाइन, और स्तनधारियों में उन लोगों के विपरीत, axolotl ependymal कोशिकाओं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में रहते हैं (एनएससी) भ्रूणीय विकास के बाद. रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद (जैसे, एक पूंछ विच्छेदन से), इन NSCs ependymal ट्यूब regrow और खो न्यूरॉन्स1,2,3की जगह करने के लिए अंतर करने के लिए proliferate. उजागर कैसे axolotl रीढ़ की हड्डी NSCs pluripotent रहते हैं और चोट के बाद सक्रिय हो मानव रोगियों के लिए नई चिकित्सीय रणनीति विकसित करने के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते हैं.
CRISPR-Cas9 जीन नॉक आउट तकनीक में प्रगति के कारण, जीन समारोह को समझने के लिए नॉक-आउट करना आसान हो गयाहै और एक्सोलोटल्स 4,5सहित विभिन्न प्रजातियों में व्यापक प्रयोज्यता के लिए दिखाया गयाहै, 6 , 7 , 8. पूर्ण एक्सोलोटल जीनोम और ट्रांसक्रिप्टोम की हाल ही में रिलीज होने से अब किसी भी जीनोमिक टिड्डी को लक्षित किया जा सकता है और बेहतर आकलन करने के लिए ऑफ-लक्ष्य प्रभाव9,10,11,12 , 13 , 14. अनुकूलित प्रोटोकॉल CRISPR-Cas9 प्रणाली15का उपयोग कर axolotls में नॉक आउट और नॉक-इन के लिए विकसित किया गया है। CAS9 प्रोटीन-GRNA ribonucleoप्रोटीन (RNP) के रूप में CRISPR-Cas9 मशीनरी की डिलीवरी Cas9 और gRNA-एन्कोडिंग प्लाज्मिड4का उपयोग करने की तुलना में अधिक कुशल होना दिखाया गया है। यह पीएलज़्मिड वैक्टर की तुलना में आकार में छोटे होने के कारण आरएनपी की संभावना है, डीएनए ब्रेक बनाने की क्षमता तुरंत, और आरएनए गिरावट से डीएनए की रक्षा। इसके अलावा, RNPs का उपयोग प्रतिलेखन और अनुवाद bypasses; इस प्रकार, यह प्रमोटर शक्ति और इष्टतम codon उपयोग के रूप में मुद्दों से बचा जाता है जब प्लाज्मिड तत्वों एक अलग प्रजाति से प्राप्त कर रहे हैं.
हानि के समारोह अध्ययन ब्याज के जीन के संभावित कार्यों की जांच करने के लिए सामान्य दृष्टिकोण में से एक हैं. पुनर्जनन के दौरान जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए, विकास पर प्रभाव से बचने के लिए एक चोट से पहले आदर्श रूप से एक नॉक-आउट किया जाना चाहिए। इसके अलावा, नॉक आउट को एनएससी और पुनर्जनन के क्षेत्र दोनों तक सीमित किया जाना चाहिए। सभी NSCs में लक्ष्य जीन का एक नॉक-आउट (मस्तिष्क में उन सहित, जो क्रे-LoxP सिस्टम में मामला है), प्रभाव पुनर्जनन है कि परिणामों की व्याख्या confound कर सकते हैं से संबंधित नहीं उत्पादन कर सकते हैं. सौभाग्य से, axolotl रीढ़ की हड्डी की संरचना समय के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है- और एनएससी में अंतरिक्ष प्रतिबंधित नॉक आउट. अधिकांश मेरुदण्डीय एन सी सी केन्द्रीय नहर के संपर्क में हैं और अधिकांश कोशिकाओं को केंद्रीय नहर16,17के संपर्क में रखते हैं . इसलिए, केंद्रीय नहर में CAS9-GRNA परिसर का एक इंजेक्शन, इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बाद, एक विशिष्ट समय4,18,19में एक वांछित क्षेत्र में रीढ़ की हड्डी एनएससी को प्रसव की अनुमति देता है. यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि यह कैसे किया जाता है, जिससे लक्षित रीढ़ की हड्डी एनएससी में अत्यधिक प्रवेश करने वाला नॉक-आउट होता है। इसके बाद के विश्लेषण को पुनर्जनन और एनएससी व्यवहार पर प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल समय और अंतरिक्ष प्रतिबंधित जीन नॉक आउट axolotl रीढ़ की हड्डी में एनएससी में बाहर की अनुमति देता है. वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च penetrance के साथ एक निर्धारित समय और स्थान पर एनएससी के विशिष्ट लक्ष्य?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उसे निरंतर और दीर्घकालिक समर्थन के लिए प्रो एली एम तनाका धन्यवाद. यह काम चीन के एक राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफसी) अनुदान (317716), अनुसंधान दक्षिण चीन सामान्य विश्वविद्यालय (S82111 और 8S0109) से अनुदान शुरू, और एक चीन Postdoctoral विज्ञान फाउंडेशन अनुदान (2018M633067) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Riferimenti
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologia dello sviluppo. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
