Direkt Gene knock-out av axolotl ryggmärgen neurala stamceller via elektroporation av CAS9 protein-gRNA komplex
Summary
Presenteras här är ett protokoll för att utföra tid-och rymdbegränsad Gene knock-out i axolotl ryggmärgen genom att injicera CAS9-gRNA komplex i ryggmärgen Central kanalen följt av elektroporation.
Abstract
Axolotl har den unika förmågan att helt återskapa sin ryggmärg. Detta beror till stor del på ependymceller celler kvar som neurala stamceller (nscs) under hela livet, som sprider sig till reformen av ependymceller röret och differentiera till förlorade nervceller efter ryggmärgsskada. Dechiffrera hur dessa NSCs behålla pluripotensen efter utveckling och försprida sig på ryggmärgsskada för att reformera den exakta pre-skada struktur kan ge värdefull insikt i hur däggdjurs ryggmärgen kan regenerera samt potentiella behandlingsalternativ. Utföra gen knock-outs i specifika undergrupper av NSCs inom en begränsad tidsperiod kommer att möjliggöra studier av de molekylära mekanismerna bakom dessa regenerativa processer, utan att blandas ihop med utvecklingen störande effekter. Beskrivs här är en metod för att utföra Gene knock-out i axolotl ryggmärg NSCs med hjälp av CRISPR-Cas9 systemet. Genom att injicera CAS9-gRNA Complex i ryggmärgs Central kanalen följt av elektroporation, är målgener slås ut i NSCs inom specifika regioner i ryggmärgen vid en önskad tidpunkt, vilket möjliggör molekylära studier av ryggmärg NSCs under Förnyelse.
Introduction
Ryggmärgen av de flesta ryggradsdjur är oförmögen att återhämta sig efter skada, vilket leder till permanent invaliditet. Flera salamandrar, såsom axolotl, är anmärkningsvärda undantag. Den axolotl kan helt regenerera en strukturellt identisk ryggmärgen och helt återställa ryggmärgen funktion. Mycket av regenerativ förmåga axolotl ryggmärgen beror på ependymceller celler. Dessa celler linje den centrala kanalen, och till skillnad från de hos däggdjur, axolotl ependymceller celler kvar som neurala stamceller (nscs) post-embryonal utveckling. Efter ryggmärgsskada (t. ex. från en svans amputation), dessa nscs föröka sig att återföds ependymceller röret och differentiera för att ersätta förlorade neuroner1,2,3. Avslöja hur axolotl ryggmärg NSCs förbli pluripotenta och blir aktiverad efter skada kan ge värdefull information om att utveckla nya terapeutiska strategier för mänskliga patienter.
På grund av framstegen i CRISPR-Cas9 gen knock-out teknik, utföra knock-outs till dechiffrera genfunktion har blivit lättare och har visat sig ha en bred tillämplighet i olika arter, inklusive axolotien4,5, 6 , 7 , 8. den senaste utgåvan av hela axolotl genom och transkriptome tillåter nu alla genomisk Locus att riktas och för bättre bedömning av off-Target effekter9,10,11,12 , 13 , 14. optimerade protokoll har utvecklats för knock-out och Knock-in i axolotien med hjälp av CRISPR-Cas9 system15. Leverans av CRISPR-Cas9 maskiner i form av Cas9 protein-grna ribonukleoprotein (RNP) har visat sig vara mer effektiv än att använda Cas9 och grna-kodning plasmider4. Detta beror sannolikt på att RNP är mindre i storlek än plasmid vektorer, dess förmåga att skapa DNA-avbrott omedelbart, och skydda gRNA från RNA-nedbrytning. Dessutom använder RNPs kringgår transkription och översättning; Sålunda, det undviker frågor som Promotorn styrka och optimal kodon användning när plasmid element härleds från en annan art.
Förlust av funktion studier är en av de allmänna metoder för att undersöka potentiella funktioner av gener av intresse. För att kunna studera genfunktion under regenereringen bör en knock-out helst utföras strax före en skada för att undvika effekter på utvecklingen. Dessutom bör utslagningar begränsas till både de nationella kontaktpunkterna och regionen för förnyelse. En knock-out av målet genen i alla NSCs (inklusive de i hjärnan, vilket är fallet i CRE-LoxP system), kan ge effekter som inte är relaterade till förnyelse som kan blanda ihop tolkningen av resultaten. Lyckligtvis ger strukturen i axolotl ryggmärgen en unik möjlighet för tid-och utrymmesbegränsade knock-out i NSCs. De flesta av ryggmärgen nscs är i kontakt med den centrala kanalen och utgör den stora majoriteten av cellerna i kontakt med den centrala kanalen16,17. Därför, en injektion av CAS9-grna komplex i den centrala kanalen, följt av elektroporation, tillåter leverans till ryggmärgen nscs i en önskad region vid en viss tidpunkt4,18,19. Detta protokoll visar hur detta utförs, vilket leder till mycket genomträngande knock-out i den riktade ryggmärgen NSCs. efterföljande analys utförs sedan för att studera effekterna på förnyelse och NSC beteende.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det beskrivna protokollet tillåter tid och utrymme begränsad gen knock-out i NSCs i axolotl ryggmärgen. Det aktuella protokollet tillåter specifik inriktning av NSCs vid en definierad tid och plats med hög penetrans. Det undviker potentiella oönskade effekter som härrör från Gene knock-out i NSCs i andra regioner som hjärnan som uppstår när du använder CRE-LoxP-systemet. Det undviker också utvecklingseffekter som härrör från en ihållande knock-out, vilket gör att studiet av genfunktion inriktad på fö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar prof. Elly M. Tanaka för hennes kontinuerliga och långsiktiga stöd. Detta arbete stöddes av en National Natural Science Foundation i Kina (NSFC) Grant (317716), forskning startbidrag från South China normal University (S82111 och 8S0109), och en China postdoktorala stiftelsen Grant (2018M633067).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Benzocaine | Sigma-Aldrich | E1501-100G | |
| Benzocaine 0.03 % (wt/vol) | Mix 500 ml of 10× TBS, 500 ml of 400% (wt/vol) Holtfreter’s solution and 30 ml of 10% (wt/vol) benzocaine stock solution. Fill up the volume to 10 L with dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Benzocaine 10 % (wt/vol) | Mix 50 g of benzocaine in 500 ml of 100% (vol/vol) ethanol. The solution can be stored at room temperature for up to 12 months. | ||
| Borosilicate glass capillaries 1.2 mm O.D., 0.94 mm I.D. | Stutter Instrument | BF120-94-8 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 102382 | |
| CAS9 buffer, 10x | Mix 200 mM HEPES and 1.5 M KCl in RNase-free water. Adjust pH to 7.5. Filter sterilize, aliquot and store at −20 °C for up to 24 months | ||
| CAS9-NLS protein | PNA Bio | CP03 | |
| Cell culture dishes, 10cm | Falcon | 351029 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Scientific Instruments | 11254-20 | |
| Electroporator | Nepa Gene | NEPA21 | |
| BEX | Pulse Generator CUY21EDIT II | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | |
| Fast Green FCF Solution, 5x | Dissolve 12.5 mg of Fast Green FCF powder in 10 mL of 1× PBS. | ||
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Stutter Instrument | P-97 | |
| Holtfreter’s solution 400% (wt/vol) | Dissolve 11.125 g of MgSO4·7H2O, 5.36 g of CaCl2·2H2O, 158.4 g of NaCl and 2.875 g of KCl in 10 L of dH2O. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| KCl | Merck | 104936 | |
| MgSO4·7H2O | Merck | 105886 | |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| NaCl | Merck | 106404 | |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV830 | |
| Ring Forceps | Fine Scientific Instruments | 11103-09 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX10 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-buffered saline, 10x | Dissolve 24.2 g of Tris base and 90 g of NaCl in 990 ml of dH2O. Adjust pH to 8.0 by adding 10 ml of 37% (vol/vol) HCl. The solution can be stored at room temperature for up to 6 months. | ||
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round Platinum Plate Electrode, 10mm diameter | Nepa Gene | CUY650P10 |
Riferimenti
- O’Hara, C. M., Egar, M. W., Chernoff, E. A. G. Reorganization of the ependyma during axolotl spinal cord regeneration: Changes in intermediate filament and fibronectin expression. Developmental Dynamics. 193 (2), 103-115 (1992).
- Mchedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the Central Nervous System During Salamander Tail Regeneration from the Implanted Neurospheres. Plant, Soil and Environment. 916 (8), 197-202 (2012).
- Nordlander, R. H., Singer, M. The role of ependyma in regeneration of the spinal cord in the urodele amphibian tail. Journal of Comparative Neurology. 180 (2), 349-373 (1978).
- Fei, J. F., et al. Tissue- and time-directed electroporation of CAS9 protein–gRNA complexes in vivo yields efficient multigene knock-out for studying gene function in regeneration. npj Regenerative Medicine. 1 (1), 16002 (2016).
- Fei, J. F., et al. CRISPR-mediated genomic deletion of Sox2 in the axolotl shows a requirement in spinal cord neural stem cell amplification during tail regeneration. Stem Cell Reports. 3 (3), 444-459 (2014).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, (2017).
- Fei, J. -. F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 201706855. , (2017).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Smith, J. J., et al. A chromosome-scale assembly of the axolotl genome. Genome Research. 373548, (2019).
- Smith, J. J., et al. Sal-Site: Integrating new and existing ambystomatid salamander research and informational resources. BMC Genomics. 6, 1-6 (2005).
- Campbell, L. J., et al. et al Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Stewart, R., et al. Comparative RNA-seq Analysis in the Unsequenced Axolotl: The Oncogene Burst Highlights Early Gene Expression in. the Blastema. PLoS Computational Biology. 9 (3), (2013).
- Fei, J. -. F., et al. Application and optimization of CRISPR–Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum). Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).
- Holder, N., et al. Continuous growth of the motor system in the axolotl. Journal of Comparative Neurology. 303 (4), 534-550 (1991).
- Tazaki, A., Tanaka, E. M., Fei, J. F. Salamander spinal cord regeneration: The ultimate positive control in vertebrate spinal cord regeneration. Biologia dello sviluppo. 432 (1), 63-71 (2017).
- Albors, A. R., Tanaka, E. M. High-Efficiency Electroporation of the Spinal Cord in Larval Axolotl. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. 1290, 115-125 (2015).
- Albors, A. R., et al. et al Planar cell polarity-mediated induction of neural stem cell expansion during axolotl spinal cord regeneration. eLife. 4, 1-29 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 34 (2), 184-191 (2016).
- Graham, D. B., Root, D. E. Resources for the design of CRISPR gene editing experiments. Genome Biology. 16 (1), 260 (2015).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
