Analyse d'activité sans anticorps pour l'analyse de l'activité de méthyltransferase d'ARN

Summary

Ici, un analyse in vitro sans anticorps pour l’analyse directe de l’activité de méthyltransferase sur l’ARN synthétique ou in vitro transcrit est décrit.

Abstract

Il y a plus de 100 modifications chimiquement distinctes de l’ARN, dont les deux tiers se composent de méthylations. L’intérêt pour les modifications de l’ARN, et en particulier les méthylations, est réapparu en raison des rôles importants joués par les enzymes qui les écrivent et les effacent dans les processus biologiques pertinents à la maladie et au cancer. Ici, un analyse in vitro sensible pour l’analyse précise de l’activité d’auteur de méthylation d’ARN sur les ARN transcrits synthétiques ou in vitro est fourni. Cet exemple utilise une forme tritiée de S-adenosyl-méthionine, résultant en l’étiquetage direct de l’ARN méthylé avec du tritium. La faible énergie du rayonnement tritium rend la méthode sûre, et les méthodes préexistantes d’amplification du signal de tritium, permettent de quantifier et de visualiser l’ARN méthylé sans l’utilisation d’anticorps, qui sont généralement sujettes aux artefacts. Bien que cette méthode soit écrite pour la méthylation de l’ARN, peu de réglages le rendent applicable à l’étude d’autres modifications de l’ARN qui peuvent être étiquetées radioactivement, comme l’acétylation d’ARN avec ¹⁴C coenzyme acétyle A. Dans l’ensemble, cet essai permet d’évaluer rapidement l’ARN conditions de méthylation, l’inhibition avec les inhibiteurs de petites molécules, ou l’effet de l’ARN ou des mutants enzymatiques, et fournit un outil puissant pour valider et élargir les résultats obtenus dans les cellules.

Introduction

L’ADN, l’ARN et les protéines sont sujets à des modifications qui régulent étroitement l’expression des gènes¹. Parmi ces modifications, les méthylations se produisent sur les trois biopolymères. L’ADN et les protéines méthylations ont été très bien étudiés au cours des trois dernières décennies. En revanche, l’intérêt pour la méthylation de l’ARN n’a été relancé que récemment à la lumière des rôles importants que les protéines qui écrivent, effacent ou lient les méthylations de l’ARN jouent dans le développement et la maladie². En plus de fonctions mieux connues dans l’abondante ribosomal et le transfert RNAs, voies de méthylation ARN réguler la stabilité spécifique de l’ARN messager^3,4, épissage⁵ et traduction^6,7, traitement miRNA^8,9 et pause transcriptionnelle et la libération^10,11.

Ici, une méthode simple et robuste pour la vérification in vitro de l’activité de méthyltransferase d’ARN dans le cadre d’un laboratoire de biologie moléculaire est rapportée (résumée dans la figure 1). Beaucoup d’études évaluent l’activité d’un méthyltransferase d’ARN par le point-blot avec un anticorps contre la modification d’ARN de l’intérêt. Cependant, point-blot ne vérifie pas l’intégrité de l’ARN lors de l’incubation avec le méthyltransferase d’ARN. Ceci est important parce que même les contaminations mineures des protéines recombinantes avec des nucléases peuvent conduire à une dégradation partielle de l’ARN et des résultats confondants. En outre, même les anticorps très spécifiques de modification d’ARN peuvent reconnaître les ARN non modifiés avec des séquences ou des structures spécifiques. L’analyse in vitro de méthyltransferase d’ARN rapportée ici tire parti du fait que la méthionine de S-adenosyl peut être tritiated sur le donneur de groupe méthyle (figure 1), permettant que l’ARN méthylé soit détecté avec précision sans l’utilisation des anticorps . Des instructions sont fournies pour la transcription in vitro et la purification d’une transcription d’intérêt et de l’essai de la méthylation de ladite transcription par l’enzyme d’intérêt. Cette méthode est flexible et robuste, et peut être ajustée en fonction des besoins de n’importe quel projet donné. Par exemple, les ARN transcrits et purifiés in vitro, les ARN synthétisés chimiquement, mais aussi les ARN cellulaires peuvent être utilisés. Cet essai fournit l’information quantitative sous forme de compte de scintillation, aussi bien que l’information qualitative en montrant où exactement l’ARN méthylé fonctionne sur un gel. Cela peut fournir un aperçu unique de la fonction d’un ARN méthyltransferase, en particulier lors de l’utilisation des ARN cellulaires comme substrat, car il fournit une méthode pour observer directement la taille de l’ARN ou des ARN qui sont ciblés pour la méthylation.

Protocol

1. Transcription in vitro et purification de gel de l’ARN cible Clonez la séquence d’intérêt en plasmides contenant des promoteurs T7 et/ou SP6 en utilisant des techniques de clonage moléculaire établies12 ou des kits. La linéarisation du modèle d’ADN pour la transcription in vitro Amplifiez la séquence d’intérêt par PCR du plasmide avec des amorces conçues pour inclure la région de promoteur T7 par l’insertion, 20-30 bp en amont et en ava…

Representative Results

Réaction de transcription in vitroFigure 2 A représente une course typique d’une réaction de transcription in vitro avec la polymérase d’ARN T7 du snRNA 7SK, qui est un ARN relativement court (331 nt) et très structuré. Comme le montre cette image brute, il existe plusieurs bandes indésirables, à la fois plus courtes et plus longues que 7SK, résultant probablement d’événements aléatoires d’initiation transcriptionnelle ou de terminaison. Pour…

Discussion

Ici, une méthode simple et robuste pour la vérification in vitro de l’activité de méthyltransferase d’ARN vers des transcriptions spécifiques est rapportée. L’analyse profite du fait que la méthionine de S-adenosyl peut être tritiaté sur le donneur de groupe méthyle (figure 1), permettant que l’ARN méthylé soit détecté avec précision sans l’utilisation d’anticorps. Cependant, il est important de noter que cet essai ne peut pas indiquer quel résidu ou groupe chimique est méth…

Materials

10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA Ladder kit.
10% Ammonium Persulfate (APS)	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter).
10X TBE Buffer	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter).
10X TBS	N/A	N/A	For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter.
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	For urea denaturing polyacrylamide gel.
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.   Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes	GE Healthcare	RPN11649	For autoradiogram gel exposure.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	For autoradiogram gel exposure.
Beckman Scintillation Counter	Beckman	LS6500	For liquid scintillation count.
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System	Biorad	1704466	Mini Horizontal Electrophoresis System.
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Applied Science	4693159001	For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.
Criterion empty Cassettes	Biorad	1656001	Vertical midi-format electrophoresis cell.
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer	DeNovix	DS-11-S	Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	For liquid scintillation count.
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials	Fisher	03-337-1	For liquid scintillation count.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer	RPI CORP	112600	For autoradiogram gel pretreatment.
Gel dryer	Biorad	1651745	For drying gel.
Gel Loading Buffer II	Ambion	AM8547	For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).
GeneCatcher disposable gel excision tips	Gel Company	NC9431993	For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.
Megascript Kit	Ambion	AM1333	For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)	Gel staining box.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.
Saran Premium Plastic Wrap	Saran Wrap	Amazon	For drying gel.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Ultra sensitive nucleic acid gel stain.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Nucleic acid gel stain.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.
TOPO TA Cloning Kit	life technologies		Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.
TURBO DNase (2 U⁄µL)	Ambion	AM2238	For DNA removal from in vitro transcription reactions.
Urea	Sigma	51456-500G	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Whatman 3MM paper	GE Healthcare	3030-154	Chromatography paper for drying gel.