כאן, אנטי נוגדן בתוך שימוש בלתי מתורבת לניתוח ישיר של פעילות מmethyltransferase על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית המועתק RNA מתואר.
ישנם יותר מ 100 שינויים כימיים ברורים של RNA, שני שלישים מהם מורכבים של מתיכי. עניין בשינויים RNA, ובעיקר מתיכי, התפתחה מחדש בשל התפקידים החשובים ששיחקו אנזימים הכותבים ומוחקים אותם בתהליכים ביולוגיים הרלוונטיים למחלות ולסרטן. כאן, רגיש בתוך שיטת החוץ הגופית לניתוח מדויק של פעילות כותב RNA מתילציה על סינתטי או בתוך מבחנה מלאכותית RNAs מסופק. שיטת הפעולה משתמשת בצורה מלאכותית של S-אדנוסיל-מתיונין, וכתוצאה מכך תיוג ישיר של RNA מתיל עם טריציום. האנרגיה הנמוכה של קרינת טריטיום עושה את השיטה בטוחה, ושיטות הקיימות מראש של טריציום הגברה האות, לאפשר לכמת ולהמחיש את רנ א מתיליום ללא שימוש של נוגדנים, אשר נוטים בדרך כלל חפצים. בעוד שיטה זו נכתבת עבור RNA מתילציה, מנופך מעטים לעשות את זה רלוונטי למחקר של שינויים אחרים RNA שיכול להיות מתויג רדיואקטיבית, כגון מרחרחון RNA עם 14C מרחלן מסוג A. בסך הכל, שיטת זה מאפשרת להעריך במהירות RNA מתילציה תנאים, עיכוב עם מעכבי מולקולה קטנה, או את ההשפעה של RNA או מוטציות אנזים, ומספק כלי רב עוצמה כדי לאמת ולהרחיב את התוצאות המתקבלות בתאים.
DNA, RNA ו חלבונים כפופים שינויים כי בחוזקה לווסת ביטוי גנים1. בין השינויים הללו מתרחשים הbiopolymers בכל שלוש הפעמים. . בשלושת העשורים האחרונים לעומת זאת, העניין ב-RNA מתילציה הוצת רק לאחרונה לאור התפקידים החשובים שחלבונים הכותבים, מוחקים או מאגד את מחלות ה-RNA של המשחק בפיתוח ובמחלות2. בנוסף לפונקציות ידועות יותר בריבוזומיום שופע והעברת rnas, RNA מתילציה מסלולים להסדיר שליח ספציפי RNA יציבות3,4, החדרת5 ותרגום6,7, מירנה עיבוד8,9 ו הפסקה ושחרור10,11.
כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מתיליראז ‘ פעילות בהגדרה של מעבדת ביולוגיה מולקולרית מדווחת (מסוכם באיור 1). מחקרים רבים להעריך את הפעילות של RNA מmethyltransferase באמצעות נקודה בכתם עם נוגדן נגד RNA שינוי של עניין. עם זאת, נקודה בכתם אינו מאמת את היושרה של RNA על הדגירה עם ה-RNA מmethyltransferase. זה חשוב כי אפילו זהום קטין של חלבונים רקומביננטי עם נוקלאוסים יכול להוביל חלקי RNA השפלה ותוצאות מייסדים. יתר על כן, אפילו מאוד ספציפי שינוי RNA נוגדנים יכול לזהות RNAs שאינם מוגדרים עם רצפים או מבנים ספציפיים. ה-RNA מתיל מתילאז שדווח כאן מנצל את העובדה כי מתיונין S-אדנוסיל יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילמת להיות מזוהה במדויק ללא שימוש בנוגדנים . הוראות מסופקות לתמלול ולטיהור של תעתיק של עניין ובדיקות של מתילציה של התמליל האמור על ידי אנזים הריבית. שיטה זו גמישה ואיתנה, וניתן להתאימו בהתאם לצרכיו של כל פרוייקט נתון. לדוגמה, בתוך מבחנה ומטוהרים RNAs, מסונתז כימית RNAs, אבל גם RNAs הסלולר ניתן להשתמש. הדבר מספק מידע כמותי בצורה של ספירות שניות, כמו גם מידע איכותני על-ידי הצגת היכן בדיוק ה-RNA המתיל פועל על ג’ל. זה יכול לספק תובנה ייחודית לתפקוד של RNA מmethyltransferase, במיוחד בעת שימוש RNAs הסלולר כמו מצע, כפי שהוא מספק שיטה ישירות להתבונן בגודל של RNA או RNAs כי הם מיועדים מתילציה.
כאן, שיטה פשוטה ואיתנה עבור אימות מחוץ לחוק של RNA מmethyltransferase פעילות כלפי התעתיקים הספציפיים מדווחים. הצורך מנצל את העובדה כי S-אדנוסיל מתיונין יכול להיות מטרימת על התורם קבוצת מתיל (איור 1), המאפשר RNA מתילאז להיות מזוהה במדויק ללא שימוש של נוגדנים. עם זאת, חשוב לציין שאין אפשרו…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לד ר טורג’ה קאנטי דבנאת על עזרתו בכמקולף. מחקר במעבדה xhemalçe הצ נתמך על ידי משרד הביטחון-Congressionally ביים תוכנית מחקר רפואי-סרטן השד פריצת דרך הפרס (W81XWH-16-1-0352), NIH גרנט R01 GM127802 והתחל כספים מהמכון לסלולר ו ביולוגיה מולקולרית והמכללה למדעי הטבע באוניברסיטת טקסס באוסטין, ארה ב.
10 bp DNA Ladder | Invitrogen | 10821-015 | 10 bp DNA Ladder kit. |
10% Ammonium Persulfate (APS) | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter). |
10X TBE Buffer | N/A | N/A | For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter). |
10X TBS | N/A | N/A | For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter. |
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher | BP1408-1 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H]) | Perkin Elmer | NET155V250UC | For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM. Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot. |
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes | GE Healthcare | RPN11649 | For autoradiogram gel exposure. |
Amersham Hyperfilm MP | GE Healthcare | 28906846 | For autoradiogram gel exposure. |
Beckman Scintillation Counter | Beckman | LS6500 | For liquid scintillation count. |
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System | Biorad | 1704466 | Mini Horizontal Electrophoresis System. |
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche Applied Science | 4693159001 | For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water. |
Criterion Cell | Biorad | 345-9902 | RNase free empty cassette for polyacrylamide gel. |
Criterion empty Cassettes | Biorad | 1656001 | Vertical midi-format electrophoresis cell. |
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer | DeNovix | DS-11-S | Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration. |
Ecoscint Original | National Diagnostics | LS-271 | For liquid scintillation count. |
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials | Fisher | 03-337-1 | For liquid scintillation count. |
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer | RPI CORP | 112600 | For autoradiogram gel pretreatment. |
Gel dryer | Biorad | 1651745 | For drying gel. |
Gel Loading Buffer II | Ambion | AM8547 | For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue). |
GeneCatcher disposable gel excision tips | Gel Company | NC9431993 | For removing bands from agarose and polyacrylamide gels. |
Megascript Kit | Ambion | AM1333 | For in vitro transcription with T7 RNA polymerase. |
Perfectwestern Extralarge Container | Genhunter Corporation | NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black) | Gel staining box. |
pRZ | Addgene | #27663 | Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends |
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup | Qiagen | 74204 | For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol. |
QIAquick Gel Extraction Kit (50) | Qiagen | 28704 | Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription. |
Saran Premium Plastic Wrap | Saran Wrap | Amazon | For drying gel. |
SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | Ultra sensitive nucleic acid gel stain. |
SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Nucleic acid gel stain. |
TE | Sigma | 93283-100ML | 10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0 |
TEMED | Fisher | 110-18-9 | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES | eppendorf | 5382000023/5361000038 | For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes. |
TOPO TA Cloning Kit | life technologies | Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription. | |
TURBO DNase (2 U⁄µL) | Ambion | AM2238 | For DNA removal from in vitro transcription reactions. |
Urea | Sigma | 51456-500G | For urea denaturing polyacrylamide gel. |
Whatman 3MM paper | GE Healthcare | 3030-154 | Chromatography paper for drying gel. |