Teste anticorpo-livre para a análise da atividade do methyltransferase do RNA

Summary

Aqui, um ensaio in vitro anticorpo-livre para a análise direta da atividade do metiltransferase no RNA transcrito sintético ou in vitro é descrito.

Abstract

Há mais de 100 modificações quimicamente distintas do RNA, dois terços dos quais consistem em metilações. O interesse nas modificações do RNA, e especialmente nos methylations, reemergiu devido aos papéis importantes desempenharam pelas enzimas que escrevem e os apagam em processos biológicos relevantes à doença e ao cancro. Aqui, um ensaio in vitro sensível para a análise exata da atividade do escritor do metilação do RNA em RNAs transcritos sintéticos ou in vitro é fornecido. Este ensaio usa um formulário tritiado de S-adenosyl-Methionine, tendo por resultado a rotulagem direta do RNA misturado com trítio. A baixa energia da radiação trítio torna o método seguro, e métodos pré-existentes de amplificação de sinal de trítio, tornam possível quantificar e visualizar o RNA metilado sem o uso de anticorpos, que são comumente propensos a artefatos. Quando este método for escrito para o methylation do RNA, poucos ajustes fazem-no aplicável ao estudo de outras modificações do RNA que podem radioativamente ser etiquetadas, tais como a acetilação do RNA com a coenzima A do acetil ¹⁴C. globalmente, este ensaio permite avaliar rapidamente o RNA condições de metilação, inibição com inibidores da molécula pequena, ou o efeito do RNA ou mutantes enzimáticos, e fornece uma ferramenta poderosa para validar e expandir os resultados obtidos nas células.

Introduction

O DNA, o RNA e as proteínas estão sujeitos a modificações que regulam firmemente a expressão gênica¹. Entre essas modificações, ocorrem metilações em todos os três biopolímeros. Os methylations do ADN e da proteína foram estudados muito bem durante as últimas três décadas. Ao contrário, o interesse no metilação do RNA foi reacendeu somente recentemente à luz dos papéis importantes que as proteínas que escrevem, apagam ou ligam o methylations do RNA jogam no desenvolvimento e na doença². Além do que funções mais conhecidas nas RNAs abundantes ribossomal e da transferência, as vias do metilação do RNA regulam a estabilidade específica^3,4do RNA do Mensageiro, emenda⁵ e a tradução^6,7, Mirna que processa^8,9 e transcricional que pausam e liberam^10,11.

Aqui, um método simples e robusto para a verificação in vitro da atividade de RNA metiltransferase no cenário de um laboratório de biologia molecular é relatado (resumido na Figura 1). Muitos estudos avaliam a atividade de um metiltransferase do RNA através do dot-borrão com um anticorpo de encontro à modificação do RNA do interesse. Entretanto, Dot-blot não verifica a integridade do RNA em cima da incubação com o methyltransferase do RNA. Isto é importante porque mesmo as contaminações menores de proteínas de recombinação com nucleases podem conduzir à degradação parcial do RNA e aos resultados confundimento. Além disso, mesmo os anticorpos altamente específicos da modificação do RNA podem reconhecer RNAs não modificado com seqüências ou estruturas específicas. O ensaio in vitro de RNA metiltransferase aqui relatado aproveita o fato de que a S-adenosil metionina pode ser tritiada no doador do grupo metil (Figura 1), permitindo que o RNA metilado seja detectado com precisão sem o uso de anticorpos . As instruções são fornecidas para in vitro a transcrição e a purificação de uma transcrição do interesse e do teste da metilação da transcrição dita pela enzima do interesse. Este método é flexível e robusto, e pode ser ajustado de acordo com as necessidades de um determinado projeto. Por exemplo, in vitro transcritos e purificados RNAs, quimicamente sintetizadas RNAs, mas também RNAs celulares podem ser usados. Este ensaio fornece informações quantitativas a forma de contagens de cintilação, bem como informações qualitativas, mostrando onde exatamente o RNA metilado é executado em um gel. Isto pode fornecer a introspecção original na função de um methyltransferase do RNA, particular ao usar RNAs celulares como um substrato, porque fornece um método para observar diretamente o tamanho do RNA ou dos RNAs que são alvejados para o methylation.

Protocol

1. a transcrição in vitro e a purificação do gel do RNA alvo Clone a seqüência de interesse em plasmíos contendo T7 e/ou SP6 promotores usando técnicas de clonagem molecular estabelecidas12 ou kits. Linearização do modelo de DNA para transcrição in vitro Amplificar a seqüência de interesse por PCR do plasmídeo com primers projetados para incluir a região promotora T7 através da pastilha, + 20-30 BP upstream e downstream como descrito …

Representative Results

Reacção de transcrição in vitroFigura 2 A representa uma corrida típica de uma reação de transcrição in vitro com o RNA polimerase T7 do 7Sk snRNA, que é um RNA relativamente curto (331 NT) e altamente estruturado. Como mostrado nessa imagem crua, existem várias bandas indesejadas, tanto mais curtas quanto mais longas que 7SK, provavelmente resultantes de eventos aleatórios de iniciação ou terminação transcripcional. Devido a isso, a puri…

Discussion

Aqui, um método simples e robusto para a verificação in vitro da atividade do metiltransferase do RNA para transcritos específicos é relatado. O ensaio aproveita o fato de que a metionina S-adenosil pode ser tritiada no doador do grupo metil (Figura 1), permitindo que o RNA metilado seja detectado com precisão sem o uso de anticorpos. No entanto, é importante notar que este ensaio não pode indicar qual resíduo ou grupo químico é metilado pela enzima. Para identificar ou verificar …

Materials

10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA Ladder kit.
10% Ammonium Persulfate (APS)	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter).
10X TBE Buffer	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter).
10X TBS	N/A	N/A	For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter.
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	For urea denaturing polyacrylamide gel.
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.   Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes	GE Healthcare	RPN11649	For autoradiogram gel exposure.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	For autoradiogram gel exposure.
Beckman Scintillation Counter	Beckman	LS6500	For liquid scintillation count.
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System	Biorad	1704466	Mini Horizontal Electrophoresis System.
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Applied Science	4693159001	For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.
Criterion empty Cassettes	Biorad	1656001	Vertical midi-format electrophoresis cell.
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer	DeNovix	DS-11-S	Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	For liquid scintillation count.
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials	Fisher	03-337-1	For liquid scintillation count.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer	RPI CORP	112600	For autoradiogram gel pretreatment.
Gel dryer	Biorad	1651745	For drying gel.
Gel Loading Buffer II	Ambion	AM8547	For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).
GeneCatcher disposable gel excision tips	Gel Company	NC9431993	For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.
Megascript Kit	Ambion	AM1333	For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)	Gel staining box.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.
Saran Premium Plastic Wrap	Saran Wrap	Amazon	For drying gel.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Ultra sensitive nucleic acid gel stain.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Nucleic acid gel stain.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.
TOPO TA Cloning Kit	life technologies		Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.
TURBO DNase (2 U⁄µL)	Ambion	AM2238	For DNA removal from in vitro transcription reactions.
Urea	Sigma	51456-500G	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Whatman 3MM paper	GE Healthcare	3030-154	Chromatography paper for drying gel.