Antilichamen-vrije assay voor analyse van RNA-methyltransferase activiteit

Summary

Hier wordt een antilichaam-vrije in-vitro test voor directe analyse van methyltransferase activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde RNA beschreven.

Abstract

Er zijn meer dan 100 chemisch verschillende modificaties van RNA, waarvan tweederde bestaat uit methylaties. Belangstelling voor RNA-modificaties, en vooral methylaties, is opnieuw ontstaan als gevolg van de belangrijke rollen die worden gespeeld door de enzymen die ze schrijven en verwijderen in biologische processen die relevant zijn voor ziekte en kanker. Hier wordt een gevoelige in vitro assay voor een accurate analyse van RNA methylatieanalyse Writer activiteit op synthetische of in vitro getranscribeerde rna’s verstrekt. Deze test maakt gebruik van een tritiumhoudend vorm van S-adenosyl-methionine, resulterend in directe etikettering van gemethyleerd RNA met tritium. De lage energie van tritium straling maakt de methode veilig, en reeds bestaande methoden van tritium signaalversterking, maken het mogelijk om te kwantificeren en het gemethyleerd RNA visualiseren zonder het gebruik van antilichamen, die vaak vatbaar zijn voor artefacten. Hoewel deze methode is geschreven voor RNA-methylering, maken enkele tweaks het toepasbaar op de studie van andere RNA-modificaties die radioactief gelabeld kunnen worden, zoals RNA acetylering met ¹⁴C acetyl coenzym A. over het algemeen maakt deze assay het mogelijk om snel te beoordelen RNA methylatieaandoeningen, remming met kleine molecuul remmers, of het effect van RNA-of enzym mutanten, en biedt een krachtig hulpmiddel om de in cellen verkregen resultaten te valideren en uit te breiden.

Introduction

DNA, RNA en eiwitten zijn onderhevig aan modificaties die genexpressie¹strak reguleren. Onder deze wijzigingen, en optreden op alle drie biopolymeren. DNA-en eiwithoudende methylaties zijn in de afgelopen drie decennia zeer goed bestudeerd. Daarentegen is de interesse in RNA-methylatie pas recentelijk geregend in het licht van de belangrijke rollen die eiwitten die het schrijven, wissen of binden van RNA-methylaties spelen in ontwikkeling en ziekte². Naast beter bekende functies in de overvloedige ribosomale en overdracht RNAS, reguleren RNA methylatietrajecten specifieke boodschapper RNA stabiliteit^3,4, splicing⁵ en vertaling^6,7, Mirna verwerkt^8,9 en transcriptionele onderbreken en vrijgeven^10,11.

Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit in de setting van een moleculair biologie laboratorium gerapporteerd (samengevat in Figuur 1). Veel studies beoordelen de activiteit van een RNA-methyltransferase door middel van dot-Blot met een antilichaam tegen de RNA-modificatie van belang. Dot-Blot controleert echter niet de integriteit van het RNA na incubatie met het RNA-methyltransferase. Dit is belangrijk omdat zelfs kleine verontreinigingen van recombinant eiwit met nucleasen kunnen leiden tot gedeeltelijke RNA afbraak en verstorende resultaten. Bovendien kunnen zelfs zeer specifieke RNA modificatie antilichamen ongemodificeerde Rna’s herkennen met specifieke sequenties of structuren. De in vitro RNA-methyltransferase assay die hier wordt gerapporteerd, maakt gebruik van het feit dat de S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen . Instructies zijn voorzien voor in vitro transcriptie en zuivering van een transcriptie van belang en het testen van de methylatieanalyse van deze transcriptie door het enzym van de belangstelling. Deze methode is flexibel en robuust, en kan worden aangepast aan de behoeften van een bepaald project. Zo kunnen in vitro getranscribeerde en gezuiverde Rna’s, chemisch samengestelde rna’s, maar ook cellulaire Rna’s worden gebruikt. Deze test verschaft kwantitatieve informatie in de vorm van scintillatie tellingen, evenals kwalitatieve informatie door te laten zien waar precies het gemethyleerd RNA op een gel draait. Dit kan een uniek inzicht bieden in de functie van een RNA-methyltransferase, vooral bij het gebruik van cellulaire Rna’s als substraat, omdat het een methode biedt om direct de grootte van het RNA of Rna’s te observeren die gericht zijn op methylatie.

Protocol

1. in vitro transcriptie en gel zuivering van het doelwit RNA Kloon de volgorde van belangstelling in plasmiden met T7 en/of SP6 promoters met behulp van gevestigde moleculaire kloontechnieken12 of Kits. Linearisatie van de DNA-template voor in vitro transcriptie Vergroot de volgorde van belangstelling per PCR van het plasmide met primers die zijn ontworpen om de T7 Promoter regio op te nemen via de insert, + 20-30 BP stroomopwaarts en stroomafwaarts …

Representative Results

In vitro transcriptie reactieFiguur 2 A vertegenwoordigt een typische run van een in vitro transcriptie reactie met de T7 RNA polymerase van het 7Sk snrna, wat een relatief korte (331 NT) en sterk gestructureerd RNA is. Zoals weergegeven op die RAW-afbeelding, zijn er meerdere ongewenste bands, zowel korter als langer dan 7SK, waarschijnlijk als gevolg van willekeurige transcriptionele initiatie-of beëindigings gebeurtenissen. Hierdoor is gel-zuivering …

Discussion

Hier wordt een eenvoudige en robuuste methode voor in-vitro verificatie van RNA-methyltransferase activiteit naar specifieke transcripten gerapporteerd. De assay maakt gebruik van het feit dat S-adenosyl methionine kan worden getritiseerd op de methylgroep donor (Figuur 1), waardoor het gemethyleerd RNA nauwkeurig wordt gedetecteerd zonder het gebruik van antilichamen. Het is echter belangrijk op te merken dat deze bepaling niet kan aangeven welke residu of chemische groep door het enzym wor…

Materials

10 bp DNA Ladder	Invitrogen	10821-015	10 bp DNA Ladder kit.
10% Ammonium Persulfate (APS)	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 10 mL, dissolve 1g in 8 mL of milliQ water; adjust volume to 10 mL with milliQ water; filter the solution using a 10 mL syringe equiped with a 0.45 µm filter).
10X TBE Buffer	N/A	N/A	For urea denaturing polyacrylamide gel (For 1L, add 108 g of Tris Base, 55 g of Boric Acid to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; add 40mL of 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0); adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22µm filter).
10X TBS	N/A	N/A	For 1L, add 60.5 g of Tris Base, 87.6 g of NaCl to a cylinder with a stir bar; add 800 mL of distilled water and let dissolve; adjust pH to 7.5 with concentrated HCl; adjust volume to 1L with milliQ water; filter the solution using a 0.22 µm filter.
Acrylamide: Bis-Acrylamide 29:1 (40% Solution/Electrophoresis), Fisher BioReagents	Fisher	BP1408-1	For urea denaturing polyacrylamide gel.
ADENOSYL-L-METHIONINE, S-[METHYL-3H]; (SAM[3H])	Perkin Elmer	NET155V250UC	For in vitro methylation of RNA; Concentration = 1.0 mCi/mL; Specific activity = 17.1 Ci/mmol; Molarity= (1.0 Ci/L)/(83.2 Ci/mmol) = 0.0584 mmol/L = 58.4 µM.   Upon receipt of the frozen 3H-SAM tube, thaw it at 4°C, make 20 µL aliquots, and freeze them at -30°C. Never refreeze and reuse a partially used aliquot.
Amersham Hypercassette Autoradiography Cassettes	GE Healthcare	RPN11649	For autoradiogram gel exposure.
Amersham Hyperfilm MP	GE Healthcare	28906846	For autoradiogram gel exposure.
Beckman Scintillation Counter	Beckman	LS6500	For liquid scintillation count.
Biorad Mini Horizontal Electrophoresis System	Biorad	1704466	Mini Horizontal Electrophoresis System.
cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets	Roche Applied Science	4693159001	For a 20X solution, dissolve 1 tablet in 0.525 mL of nuclease free water.
Criterion Cell	Biorad	345-9902	RNase free empty cassette for polyacrylamide gel.
Criterion empty Cassettes	Biorad	1656001	Vertical midi-format electrophoresis cell.
DeNovix DS-11 Microvolume Spectrophotometer	DeNovix	DS-11-S	Microvolume Spectrophotometer for measuring DNA and RNA concentration.
Ecoscint Original	National Diagnostics	LS-271	For liquid scintillation count.
Fisherbrand 7mL HDPE Scintillation Vials	Fisher	03-337-1	For liquid scintillation count.
Fluoro-Hance-Quick Acting Autoradiography Enhancer	RPI CORP	112600	For autoradiogram gel pretreatment.
Gel dryer	Biorad	1651745	For drying gel.
Gel Loading Buffer II	Ambion	AM8547	For loading RNA in denaturing polyacrylamide urea gel (composition: 95% Formamide, 18 mM EDTA, and 0.025% SDS, Xylene Cyanol, and Bromophenol Blue).
GeneCatcher disposable gel excision tips	Gel Company	NC9431993	For removing bands from agarose and polyacrylamide gels.
Megascript Kit	Ambion	AM1333	For in vitro transcription with T7 RNA polymerase.
Perfectwestern Extralarge Container	Genhunter Corporation	NC9226382 (clear)/ NC9965364 (black)	Gel staining box.
pRZ	Addgene	#27663	Plasmid for producing in vitro transcripts with homogeneous ends
Qiagen RNeasy MinElute Cleanup	Qiagen	74204	For RNA clean-up, use modified protocol provided in the protocol.
QIAquick Gel Extraction Kit (50)	Qiagen	28704	Kit for gel extraction and clean up of dsDNA fragment used for in vitro transcription.
Saran Premium Plastic Wrap	Saran Wrap	Amazon	For drying gel.
SYBR Gold	Invitrogen	S11494	Ultra sensitive nucleic acid gel stain.
SYBR Safe	Invitrogen	S33102	Nucleic acid gel stain.
TE	Sigma	93283-100ML	10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 8.0
TEMED	Fisher	110-18-9	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Thermomixer with SMARTBLOCK 24X 1.5mL TUBES	eppendorf	5382000023/5361000038	For temperature controlled incubation of 1.5 mL tubes.
TOPO TA Cloning Kit	life technologies		Kits for fast cloning of Taq polymerase–amplified PCR products into vectors containing T7 and/or SP6 promoters for in vitro RNA transcription.
TURBO DNase (2 U⁄µL)	Ambion	AM2238	For DNA removal from in vitro transcription reactions.
Urea	Sigma	51456-500G	For urea denaturing polyacrylamide gel.
Whatman 3MM paper	GE Healthcare	3030-154	Chromatography paper for drying gel.