Детергент-помощь Восстановление рекомбинантных Drosophila Аластин в липосомы для Липид-смешивания анализы
Summary
Биологический мембранный синтез катализируется специализированными белками синтеза. Измерение фусогенных свойств белков может быть достигнуто путем липидных анализов смешивания. Мы представляем метод очистки рекомбинантного дрозофила атластина, белка, который опосредует гомотипическое слияние ER, воссоздавая его до предварительно сформированных липосом и тестируя на способность синтеза.
Abstract
Мембранный синтез является решающим процессом в эукариотической клетке. Специализированные белки необходимы для катализа синтеза. Аластины являются эндоплазмическими белками-резидентами (ER), замешанными в гомотипическом слиянии ER. Мы подробно здесь метод очистки глутатион S-трансферазы (GST) и поли-гистидин помечены Drosophila atlastin двумя раундами сродства хроматографии. Изучение реакции синтеза в пробирке требует очищенных белков синтеза, которые должны быть вставлены в липидный двухслойный. Липосомы являются идеальными модельными мембранами, так как липидный состав и размер могут быть скорректированы. С этой целью мы описываем метод восстановления моющего средства для удаления дрозофилы атластин в предварительно сформированные липосомы. Хотя несколько методов восстановления доступны, восстановление моющих средств удаления имеет ряд преимуществ, которые делают его пригодным для атластинов и других подобных белков. Преимуществом этого метода является высокая урожайность восстановления и правильная ориентация восстановленного белка. Этот метод может быть распространен на другие мембранные белки и для других применений, которые требуют протеолипомы. Кроме того, мы описываем FRET основе липидных смешивания ассси протеолипомы, используемые в качестве измерения мембранного синтеза.
Introduction
Мембранный синтез является критическим процессом во многих биологических реакциях. При биологических условиях слияние мембран не является спонтанным и требует специализированных синтеза белков для катализировать такие реакции1. ER гомотипический мембранный синтез опосредования у животных динамина связанных GTPase атластина2. Роль Аластина в гомотипическом синтезе имеет основополагающее значение для трехсторонних узлов в периферийных ER, который представляет собой большую взаимосвязанную сеть труб, которые простираются по всей клетке. Аластины имеют сохраненную морфологию домена, состоящую из большого GTPase, три спирали расслоение среднего домена, гидрофобный якорь мембраны, и короткий цитоплазмический C-терминал хвост3. Исследования в пробирке с рекомбинантным дрозофила атластина показали, что при восстановлении липосомы, он сохраняет свои фузогенные свойства. Другие аластины, в том числе человеческие омологи, не смогли резюмировать синтез в пробирке. Мы описываем здесь методологию для очищения GST и поли-гистидина помечены рекомбинантных Drosophila atlastin, восстановление его липосомы, и отслеживание слияния.
Изучение мембранного синтеза в пробирке представляет собой проблему, как фусогенные белки, как правило, мембраны якорь. Для того, чтобы изучить их, необходимо воссоздать их в модель липидных двухслойных. Большие униламеллярные пузырьки (LUV) являются полезным инструментом для изучения взаимодействия липидных белков. Мы представляем здесь систему, чтобы сделать LUVs различных липидных композиций для восстановления белка и синтеза анализов. Восстановление интегральных белков в LUVs может быть достигнуто с помощью различных методов, включая, органический растворитель опосредоченной реконституции, механические механизмы, или моющее средство при содействии восстановления4. Мы представляем здесь метод для воссоздания Drosophila атластина в предварительно сформированные липосомы путем удаления моющего средства. Преимущества этого метода восстановления включают высокие урожаи восстановления и правильную ориентацию атласина в липидном двухслойном. Кроме того, с помощью этого метода, белок не высушивается или подвергается воздействию органических растворителей, тем самым сохраняя структуру и функцию. Среди его недостатков, наличие моющих средств не может быть идеальным для всех белков и окончательные протеолипосомы могут иметь некоторые включены моющего средства в липидный двуслой. Дальнейший диализ может быть использован для устранения большего количества моющего средства. Тем не менее, диализ может занять много времени и, следовательно, может привести к потере белковой активности.
Оценка синтеза активности атластин может быть определена липидных смешивания анализы, как ранее описано2. Здесь мы разграничив метод измерения атластина опосредованного синтеза через N-(7-нитробенц-2-окса-1,3-диазол-4-ил (NBD)/Лиссамин родамин-B сульфонил (родамин) помечены липидов. Этот ассеид требует слияния доноров (помеченных) протеолипосом и приемотеля (немаркированных) протеолипосом. Освобождение FRET может быть измерено во время реакции как разбавление пары донора-приемника от “помеченных” липосом до “немаркированных” липосом в результате перемешивания липидов во время мембранного синтеза (Рисунок 1)5. Хотя этот показатель служит прокси для мембранного синтеза, он ограничен в различении мембранного синтеза и гемифузии, состояние, в котором смешиваются только внешние листовки. Для решения этой проблемы, альтернативой является внешняя листовка закалки NBD dithionite. Следуя той же методологии, как NBD / родамин липидных анализов, при закалке внешней листовки любой релиз NBD FRET путем слияния будет связано с внутренней листовки смешивания8.
Альтернативные анализы синтеза внутренним ваквистым содержанием смешивания адрес полного слияния только5. Примерами этого являются анализы тербия (Тб)/дипиколининовой кислоты (DPA) и анализы аминонафталенной трисульфонной кислоты (ANTS)/p-xylene bis (pyridinium) бромид (DPX). В Тб/ДПА анализы, пул липосом с инкапсулированным Тб смешиваются и сливается с липосомы с инкапсулированными DPA; при слиянии, флуоресценция увеличивается за счет внутренней передачи энергии от DPA к ТБ в рамках «Tb (DPA)3»3- хелатоэнсивный комплекс6. В отличие от этого, для ANTS / DPX анализы, ANTS флуоресценция угасает DPX7. В то время как эти системы решают проблему внутреннего смешивания содержимого, для удаления неинкапсулированных реагентов требуется более углубленное приготовление липосом, а также непреднамеренное взаимодействие флюорофоров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Методы здесь разграничены эффективный метод очистки, восстановления и измерения термоядерного синтеза активности рекомбинантного аластин. Для обеспечения высоких урожаев функционального атластина необходимо рассмотреть некоторые критические шаги. Выражение атласина должно быть с…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Майкла Стерна и его лабораторию за их понимание и обратную связь по атластинам, связанным с проектами. Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (R01GM101377) и Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (R01NS102676).
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
Riferimenti
- Chernomordik, L. V., Kozlov, M. M. Mechanics of membrane fusion. Nature Structural and Molecular Biology. 15, 675-683 (2008).
- Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like GTPase Atlastin. Nature. 460, 978-983 (2009).
- McNew, J. A., Sondermann, H., Lee, T., Stern, M., Brandizzi, F. GTP-dependent membrane fusion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 529-550 (2013).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1231, 223-246 (1995).
- Düzgüneş, N. Fluorescence Assays for Liposome Fusion. Methods in Enzymology. 372, 260-274 (2003).
- Wilschut, J., Duzgunes, N., Fraley, R., Papahadjopoulos, D. Studies on the mechanism of membrane fusion: kinetics of calcium ion induced fusion of phosphatidylserine vesicles followed by a new assay for mixing of aqueous vesicle contents. Biochimica. 19, 6011-6021 (1980).
- Ellens, H., Bentz, J., Szoka, F. C. Proton- and calcium-induced fusion and destabilization of liposomes. Biochimica. 24, 3099-3106 (1985).
- Meers, P., Ali, S., Erukulla, R., Janoff, A. S. Novel inner monolayer fusion assays reveal differential monolayer mixing associated with cation-dependent membrane fusion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1467, 277-243 (2000).
- Schaffner, W., Weissmann, C. A rapid, sensitive, and specific method for the determination of protein in dilute solution. Analytical Biochemistry. 56, 502-514 (1973).
- MacDonald, R. C., et al. Small-volume extrusion apparatus for preparation of large, unilamellar vesicles. Biochimica Et Biophysica Acta. 1061, 297-303 (1991).
- Paternostre, M. T., Roux, M., Rigaud, J. L. Mechanisms of membrane protein insertion into liposomes during reconstitution procedures involving the use of detergents. 1. Solubilization of large unilamellar liposomes (prepared by reverse-phase evaporation) by Triton X-100, octyl glucoside, and sodium cholate. Biochimica. 27, 2668-2677 (1988).
- Scott, B. L., et al. Liposome Fusion Assay to Monitor Intracellular Membrane Fusion Machines. Methods in Enzymology. 372, 274-300 (2003).
- Zhang, W., et al. Crystal structure of an orthomyxovirus matrix protein reveals mechanisms for self-polymerization and membrane association. PNAS. 114, 8550-8555 (2017).
- Parlati, F., et al. Rapid and efficient fusion of phospholipid vesicles by the α-helical core of a SNARE complex in the absence of an N-terminal regulatory domain. PNAS. 96, 12565-12570 (1999).
- Sugiura, S., Mima, J. Physiological lipid composition is vital for homotypic ER membrane fusion mediated by the dynamin-related GTPase Sey1p. Scientific Reports. 6, 20407 (2016).
- Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components. Nature. 543, 257-260 (2017).
- Betancourt-Solis, M. A., Desai, T., McNew, J. A. The atlastin membrane anchor forms an intramembrane hairpin that does not span the phospholipid bilayer. Journal of Biological Chemistry. 293, 18514-18524 (2018).
