Ricostituzione assistita da detergenti della Drosophila ricombinante Atlastin in Liposomi per i saggi che mescolano i lipidi
Summary
La fusione biologica della membrana è catalizzata da proteine di fusione specializzate. Misurare le proprietà fusogene delle proteine può essere ottenuto mescolando saggi. Vi presentiamo un metodo per purificare la Drosophila ricombinante atlastina, una proteina che media la fusione omotipica del ER, riconformandola in liposomi preformati e testando la capacità di fusione.
Abstract
La fusione a membrana è un processo cruciale nella cellula eucarica. Proteine specializzate sono necessarie per catalizzare la fusione. Le atlastine sono proteine residenti nell’endoplasmico (ER) implicate nella fusione omotipica del ER. Abbiamo descritto qui un metodo per purificare un glutathione S-transferase (GST) e poli-istidina etichettato Drosophila atlastina da due cicli di cromatografia di affinità. Lo studio delle reazioni di fusione in vitro richiede l’inserimento di proteine di fusione purificate in un bistrato lipidico. I liposomi sono membrane modello ideale, come la composizione e le dimensioni dei lipidi possono essere regolati. A tal fine, descriviamo un metodo di ricostituzione mediante rimozione del detergente per la Drosophila atlastin a liposomi preformati. Sebbene siano disponibili diversi metodi di ricostituzione, la ricostituzione mediante rimozione del detergente presenta diversi vantaggi che lo rendono adatto per atlastini e altre proteine simili. Il vantaggio di questo metodo include un’elevata resa di ricostituzione e un corretto orientamento della proteina ricostituita. Questo metodo può essere esteso ad altre proteine della membrana e per altre applicazioni che richiedono proteoliposomi. Inoltre, descriviamo un saggio di miscelazione dei lipidi a base di FRET di proteoliposomi utilizzati come misura della fusione della membrana.
Introduction
La fusione a membrana è un processo critico in molte reazioni biologiche. In condizioni biologiche, la fusione della membrana non è spontanea e richiede proteine di fusione specializzate per catalizzare tali reazioni1. Er fusione della membrana otipipica è mediata negli animali dal dinamino correlato GTPase atlastin2. Il ruolo di Atlastin nella fusione omotipica è fondamentale per le giunzioni a tre vie nel ER periferico, che costituisce una grande rete interconnessa di tubuli che si estendono in tutta la cellula. Atlastins hanno una morfologia di dominio conservato costituito da una grande GTPase, un dominio intermedio fascio di tre elicoie, un’ancora di membrana idrofobica, e una breve coda citoplasmatica C-terminal33. Studi in vitro con drosophila ricombinante alla Drosophila atlastin hanno dimostrato che, una volta ricostituito per i liposomi, mantiene le sue proprietà fusogene. Altri atlastini, compresi gli omologhi umani non sono stati in grado di ricapitolare la fusione in vitro. Descriviamo qui una metodologia per purificare un GST e la poli-idina etichettata come l’atsolazione ricombinante della Drosophila, riconciliandola ai liposomi e rivaleggere la fusione.
Lo studio della fusione della membrana in vitro rappresenta una sfida in quanto le proteine fusogene di solito hanno un’ancora di membrana. Per studiarli, è necessario ricostituirli in modelli di bistrati lipidici. Le grandi vesciche di unilamellar (LUV) sono uno strumento utile per studiare le interazioni delle proteine lipidi. Vi presentiamo qui un sistema per fare LUV di diverse composizioni lipidiche per la ricostituzione delle proteine e i saggi di fusione. La ricostituzione delle proteine integrali nei LLU può essere ottenuta con una varietà di metodi, tra cui la ricostituzione organica mediata dal solvente, i meccanismi meccanici o la ricostituzione assistita dal detersivo4. Vi presentiamo qui un metodo per ricostituire la Drosophila atlastina in liposomi preformati mediante rimozione del detersivo. I vantaggi di questo metodo di ricostituzione includono elevati rendimenti di ricostituzione e un corretto orientamento di atlastin nel bistrato lipidico. Inoltre, attraverso questo metodo, la proteina non viene essiccata o esposta a solventi organici mantenendo così la struttura e la funzione. Tra i suoi svantaggi, la presenza di detergenti potrebbe non essere ideale per tutte le proteine e i proteoliposomi finali possono avere qualche detergente incorporato nel bistrato lipidico. Ulteriore dialisi può essere utilizzata per eliminare più del detersivo. Tuttavia, la dialisi può richiedere molto tempo e può quindi portare alla perdita di attività proteica.
La valutazione dell’attività di fusione di atlastin può essere determinata mescolando saggi come descritto in precedenza2. Qui, deperiamo un metodo per misurare la fusione mediata atlastina attraverso i lipidi etichettati N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl (NBD)/Lissamine rhodamine-B sulfonyl (rhodamine). Questo saggio richiede la fusione di proteoliposomi donatore (etichettato) e proteoliposomi accettatori (senza etichetta). Un rilascio di FRET può essere misurato durante la reazione come la diluizione di una coppia donatore-acceleratore da liposomi “etichettati” a liposomi “senza etichetta” come risultato della miscelazione dei lipidi durante la fusione della membrana (Figura 1)5. Mentre questo test serve come proxy per la fusione della membrana, è limitato nel distinguere tra fusione della membrana ed emifusione, uno stato in cui solo i volantini esterni si mescolano. Per risolvere questo problema, un’alternativa è l’eliminazione di NBD da parte di NBD per dithionite. Seguendo la stessa metodologia dei pronostici di miscelazione dei lipidi NBD/rhodamine, dopo aver placato il volantino esterno qualsiasi rilascio NBD FRET mediante fusione sarà dovuto alla miscelazione interna dei volantini8.
Saggi di fusione alternativa da contenuti acquosi interni mixaggio indirizzo full fusion solo5. Esempi di questo sono i saggi di terbio (Tb)/dipicolinic acid (DPA) e i saggi di acido trisulfonico aminonaftalene (ANTS)/p-xylene bis(pyridinium) (DPX). Nei saggi Tb/DPA, un pool di liposomi con Tb incapsulato viene miscelato e fuso con liposomi con DPA incapsulato; al momento della fusione, la fluorescenza viene aumentata attraverso il trasferimento interno di energia da DPA a Tb all’interno del complesso [Tb(DPA)3]3- chelazione6. Al contrario, per i saggi ANTS/DPX, la fluorescenza ANTS viene spenta da DPX7. Mentre questi sistemi affrontano la miscelazione del contenuto interno, è necessaria una preparazione più approfondita dei liposomi per la rimozione di reagenti non incapsulati, così come l’interazione involontaria dei fluorofori.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi qui delineano un metodo efficiente per purificare, riclassificare e misurare l’attività di fusione dell’atlastina ricombinante. Per garantire alte rese di atlastina funzionale alcuni passaggi critici devono essere considerati. L’espressione di atlastin deve essere fatta a basse temperature (16 ) per evitare l’aggregazione e si dovrebbe puntare a una concentrazione finale tra 0,4-1,5 mg/mL. Le proteine molto diluite non saranno ricostituite in modo ottimale a un rapporto tra 1:400 proteine e lipidi. L’efficienza…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Michael Stern e il suo laboratorio per le loro intuizioni e feedback su atlastin progetti correlati. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences [R01GM101377] e dall’Istituto Nazionale di Disturbi Neurologici e Ictus [R01NS102676].
Materials
| 10 mL poly-prep chromatography columns | Biored | 731-1550 | |
| 10 x 75 mm Flint glass tubes | VWR | 608225-402 | |
| 47 mm diameter, 0.45um pore whatman sterile membrane filters | Whatman | 7141 104 | |
| 96 well white plate | NUNC | 437796 | |
| Anapoe X-100 | Anatrace | 9002-931-1 | |
| Cell disrupter | Avestin | Avestin Emulsiflex C3 | |
| DOPS (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt)) | Avanti | 840035P-10mg | DOPS |
| EDTA | Research organics inc. | 6381-92-6 | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001 | Complete protease inhibitor |
| Extruder | Sigma Aldrich | Z373400 | Liposofast Basic Extruder |
| GE Akta Prime liquid chromatography system | GE Pharmacia | 8149-30-0006 | |
| Glutathione agarose beads | Sigma aldrich | G4510-50ml | |
| Glycerol | EMD | GX0185-5 | |
| GTP | Sigma Aldrich | 36051-31-7 | Guanosine 5' triphosphate sodium salt hydrate |
| HEPES, acid free | Omnipur | 5330 | |
| Imidazole | fluka | 5670 | |
| Immobilized metal affinity chromatography (IMAC) resin column | GE Healthcare | 17040801 | 1 mL HiTrap Chelating HP immobilized metal affinity chromatography columns |
| Iohexol | Accurate chemical and scientific corporation | AN 7050 BLK | Accudenz/Nycodenz |
| IPTG | Research products international corp. | I56000-100.0 | IPTG, dioxane free |
| L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251-5g | |
| Magnesium chloride | Fisher | 7791-18-6 | |
| Methanol | Omnisolv | MX0488-1 | |
| NBD-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | NBD-DPPE |
| n-Dodecyl β-D-maltoside | Chem-Impex International | 21950 | |
| Nonpolar polystyrene adsorbent beads | BioRad | 152-3920 | SM2 Biobeads |
| Nuclepore track-etch polycarbonate 19 mm 0.1 um pore membrane | Whatman | 800309 | |
| Optima LE80K Ultra centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Phosphatidylcholine, L-α-dipalmitoyl [choline methyl-3H] | ARC | ART0284 | Titriated lipids |
| Plate reader | TECAN | TECAN infinite M200 plate reader | |
| POPC (1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine) | Avanti | 850457C-25mg | POPC |
| Potassium chloride | MP | 151944 | |
| Rh-DPPE (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)) | Avanti | 236495 | Rh-DPPE |
| Scintillation Cocktail | National Diagnostics | LS-272 | Ecoscint XR Scintillation solution for aqueous or non-aqueous samples |
| Scintillation vials | Beckman | 592928 | Fast turn cap Mini Poly-Q Vial |
| Thrombin | Sigma | T1063-1kU | Thrombin from human plasma |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-500 | |
| Ultra-clear centrifuge tubes 5 x 41 mm | Beckman | 344090 | |
| Vortex 9 to 13mm Tube Holder | VWR | 58816-138 | Insert for vortexing flint glass tubes |
| Vortex Insert Retainer | VWR | 58816-132 | Retainer needed for vortex tube holder |
| Vortexer | VWR | 2.235074 | Vortex Genie 2 model G560 |
| β-mercaptoethanol molecular biology grade | Calbiochem | 444203 |
Riferimenti
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