Her præsenterer vi en protokol til effektivt og specifikt nedbryder et protein af interesse i gær Saccharomyces cerevisiae ved hjælp af β-Est Aid system.
Anlægget auxin binding receptor, TIR1, genkender proteiner, der indeholder en specifik auxin-inducerbar degron (støtte) motiv i nærværelse af auxin, målrette dem for nedbrydning. Dette system udnyttes i mange ikke-plante eukaryoter, således at et målprotein, mærket med støtte motivet, nedbrydes ved auxin tilsætning. Niveauet for TIR1-udtrykket er kritisk. overdreven ekspression fører til nedbrydning af den hjælp-mærkede protein selv i fravær af auxin, mens lav ekspression fører til langsom udtømning. Der blev oprettet et β-østradiol-inducerbart støttesystem med ekspression af TIR1 under kontrol af en β-estradiol-inducerbar promotor. Niveauet af TIR1 er tunbart ved at ændre tidspunktet for inkubation med β-estradiol før auxin tilsætning. Denne protokol beskriver, hvordan man hurtigt nedbryder et målprotein ved hjælp af støttesystemet. Den rette inkubationstid for β-estradiol afhænger af den overflod af målproteinet. Derfor er effektiv udtynding afhængig af optimal timing, der også minimerer auxin-uafhængig nedbrydning.
Betingede mutationer, såsom temperaturfølsomme mutanter, er et kraftfuldt værktøj til studiet af essentielle proteiner, der tillader cellevækst under den eftergivende tilstand, men forårsager tab af funktion under ikke-eftergivende betingelser. Men, cellemetabolisme kan være alvorligt forvirret af ændringen i vækstbetingelser, der kræves for at fremkalde defekten og kan også skabe off-Target effekter. Flere metoder er blevet udviklet, hvor proteinet af interesse er betinget afsondret1 eller dens udtryk er kontrolleret2,3 ved tilsætning af et lille molekyle. Denne protokol bruger auxin og det auxin-inducerbare degron (AID) system til effektivt at nedbryder et målprotein.
Støtteordningen har sin oprindelse i anlæg, hvor der anvendes en auxin (i denne protokol indol-3-eddikesyre (IAA)), stimulerer interaktionen mellem Aux/IAA-proteinet og TIR1, et medlem af SCF U3 ubiquitin ubiquitinligase Complex4. SCF Complex interaktion forårsager polyubiquitination af AUX/IAA familie proteiner, hvilket resulterer i deres nedbrydning af proteasomet5,6.
Dette system blev tidligere tilpasset til brug i gær Saccharomyces cerevisiae7,8 ved at udtrykke TIR1 protein fra Oriza sativa (ostir) i gærceller, hvor det er i stand til at interagere med den endogene gær SCF-kompleks. Det protein af interesse blev mærket med et motiv fra AUX/IAA protein IAA17 at målrette det for nedbrydning. Funktionelle trunkationer af IAA17 blev udviklet senere, såsom støtte *8,9,10, indeholdende 43 aminosyre auxin-følsomme motiv fra Arabidopsis thaliana IAA17, sammen med en epitop tag for at muliggøre Påvisning.
Systemet oprindeligt tilpasset til brug i spirende gær7,8 udtrykte osTIR1 protein fra en gær gal promotor. Udtryk kræver Skift til vækstmedium med galactose som den eneste kulstofkilde, som desværre resulterer i et diauxic Skift med vidtrækkende ændringer i cellemetabolisme11. På den anden side er det blevet rapporteret, at konstitutiv ekspression af TIR1 kan føre til nedbrydning af målproteinet i fravær af auxin/IAA12 , hvis udtryks niveauet er højt, HVORIMOD lavt TIR1 udtryk forårsager ineffektiv udtømning. Et forbedret støttesystem med navnet β-Est AID blev udviklet, hvor osTIR er under kontrol af en inducerbar promotor, der er tunable til at passe til målproteinet, med minimal effekt på cellernes metabolisme. For at opnå dette, en kunstig transkriptionsfaktor (ATF) blev konstrueret, hvor VP16 viral transskription aktivator er smeltet til en østrogen receptor og en fire Zn fingre DNA binding domæne (dbd). Når β-estradiol (et østrogen) er til stede, kan ATF trænge ind i kernen og inducere ostir transkriptionen ved at binde sig til sin promotor (Z4EVpr)13,12.
osTIR-ekspression er normalt detekterbar ca. 20 min efter tilsætning af β-østradiol12. Den optimale varighed af osTIR-ekspression for at opnå effektiv udtømning af det mærkede protein med auxin, samtidig med at man undgår nedbrydning før auxin-tilsætning, skal dog bestemmes empirisk for hvert målprotein. En omtrentlig tid for denne præ-inkubation kan estimeres ud fra forekomst værdier i Saccharomyces Genome databasen (SGD https://www.yeastgenome.org/). Som det kan ses i figur 1, det rigelige protein, Dcp1 (2880 til 4189 molekyler/celle), kræver 40 min præ-inkubation med β-estradiol, uden auxin-uafhængig nedbrydning observeret. Den meget mindre rigelige protein, Prp2 (172 til 211 molekyler/celle), er stærkt forarmet efter kun 20 min af præ-inkubation. Det er tilrådeligt at teste to yderligere præ-inkubationstider, 10 til 20 min før eller efter denne indledende anslåede tid (20 min er den mindste tid, der anbefales). Den optimale præ-inkubationstid er det tidspunkt, hvor målproteinet ikke er opbrugt, før du tilføjer auxin, og når auxin tilsættes, er nedbrydningen acceptabel, eller protein niveauerne nærmer sig det mindste mulige. Så fra figur 1b, for Prp22 med 30 min før inkubation, har niveauerne ikke faldet meget 10 min efter auxin tilsætning. Ved at sammenligne dette med 40 min før inkubation og 15 min med IAS, hvor der kun er lidt ekstra udtynding, er der ingen fordel ved at inkube med auxin længere end 10 min eller præinkuberet i mere end 30 minutter, især da der er tegn på ikke-auxin afhængig udtømning ved 40 min. For Dcp1 med 40 min præ-inkubation (det sidste punkt, hvor proteinniveauet er ca 100% før auxin tilsætning), 15 til 20 min af udtynding med auxin er acceptabelt. Det anbefales at holde nedbrydningen tid så kort som muligt at reducere sekundære virkninger på cellemetabolisme14.
Denne artikel viser, hvordan man bruger β-Est-hjælpesystemet ved at optimere timingen af β-estradiolinkubation for osTIR-ekspression for at opnå hurtig målprotein udtynding ved tilsætning af IAA uden nedbrydning, før auxin tilføjes.
En godt optimeret protokol kan producere hurtig og effektiv udtømning af målproteinet. Det er vigtigt at bestemme den omtrentlige præ-inkubationstid med β-estradiol, da dette øger reproducerbarhed af nedbrydningen, men små variationer i præ-inkubationstiden kan tolereres. På den anden side skal man være forsigtig med timing efter auxin tilsætning, da proteinniveauet falder meget hurtigt.
En fordel ved denne fremgangsmåde er, at tunet udtynding kan opnås ved varierende kombinationer af præ-inkubationstid med β-estradiol og IAA inkubationstiden. For eksempel, hvis det ønskes, kan målproteinet være mere langsomt forarmet ved at reducere præ-inkubationstiden.
Det β-Este støttesystem giver visse fordele i forhold til systemer, hvor OsTIR udtrykkes i forfatningsgrad. Hvis målproteinet for eksempel er afgørende for levedygtigheden, kan det regulerede udtryk for osTIR undgå for tidlig udtømning af målproteinet. Desuden kan ekspression af osTIR indstilles til at passe til den overflod af målproteinet og dets modtagelighed for nedbrydning, og nedbrydningen kan enten være hurtig eller langsom. De to små molekyle efftorer, β-estradiol og auxin, ikke forstyrrer gær metabolisme under de betingelser, der anvendes her, i modsætning til Rapamycin, anvendes i anker-Away system1.
Det skal bemærkes, at tagging nogle proteiner forstyrrer deres funktion, hvilket er et problem med enhver målrettet nedbrydning system. I dette tilfælde kan et N-terminal-tag fungere, når et C-Terminal-tag ikke gør det. Også, ikke alle proteiner vil blive opbrugt effektivt; f. eks. kan støtte mærket på målproteinet være utilgængeligt for osTIR-proteinet. Derfor bør hvert målprotein efter støtte mærkning testes for enhver effekt af mærket på vækst og for at afgøre, om udtynding er effektiv, før timingerne af β-estradiol præ-inkubation og auxin-behandling optimeres.
Dette støttesystem er meget enkelt og er kompatibelt med enhver efterfølgende eksperimentel procedure, der ikke indebærer yderligere vækst, såsom protein, DNA eller RNA-analyse eller mikroskopi. Derudover fungerer systemet godt, når det kombineres med thiolabelling for at rense spirende RNA20.
Dette system giver en hurtig, specifik, og reproducerbare midler til at nedbryder et protein uden på anden måde påvirker metabolismen af gærcellen.
The authors have nothing to disclose.
Takket være Jane Reid for at starte dette program, Barbara Terlouw for udvikling, Vahid Aslanzadeh for “URA Looper” konstruktioner og Susana de Lucas for mange nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet af et stipendium til GIMO fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Mexico (CONACYT) og University of Edinburgh School of Biological Sciences, et Wellcome PhD-Studentship til IEM [105256] og af Wellcome-finansiering [104648] til JD Beggs . Arbejdet i Wellcome Center for Cell Biology understøttes af Wellcome Core-finansiering [092076].
Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Β-estradiol | Sigma Aldrich | E2758-1G | 10mM solution in ethanol. Store at -20 oC |
DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO should be solid at 4 oC |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
IAA 1H-Indole-3-acetic acid | Across Orgainics | 122150100 | Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530 | |
Peptone | Formedium | PEP03 | |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Yeast Extract | Formedium | YEA03 | |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 |