Her presenterer vi en protokoll for å effektivt og spesifikt bryter ut et protein av interesse i gjær Saccharomyces cerevisiae ved hjelp av β-EST Aid system.
Anlegget auxin bindende reseptor, TIR1, gjenkjenner proteiner som inneholder en bestemt auxin-induserbart degron (AID) motiv i nærvær av auxin, rettet mot dem for fornedrelse. Dette systemet er utnyttet i mange ikke-plante Landplantenes, slik at et mål protein, merket med AID motivet, er degradert ved auxin tillegg. Nivået av TIR1-uttrykk er kritisk. overdreven uttrykk fører til nedbrytning av AID-Tagged protein selv i fravær av auxin, mens lave uttrykk fører til langsom tømming. En β-østradiol-induserbart AID system ble opprettet, med uttrykk for TIR1 under kontroll av en β-østradiol induserbart promoter. Nivået på TIR1 er tunable ved å endre tidspunktet for inkubasjons med β-østradiol før auxin tillegg. Denne protokollen beskriver hvordan du raskt tømmer et mål protein ved hjelp av AID-systemet. Den aktuelle β-østradiol inkubasjonstid avhenger av overflod av målet protein. Derfor avhenger effektiv tømming av optimal timing som også minimerer auxin-uavhengig tømming.
Betingede mutasjoner, som temperaturfølsomme mutanter, er et kraftig verktøy for studiet av essensielle proteiner, slik at cellevekst under ettergivende tilstand, men forårsaker tap av funksjon under ikke-ettergivende forhold. Imidlertid kan celle metabolisme være alvorlig perturbed av endringen i vekstforhold som kreves for å indusere feilen og kan også skape off-Target effekter. Flere metoder er utviklet, der protein av interesse er betinget sequestered1 eller dets uttrykk styres2,3 ved tilsetning av et lite molekyl. Denne protokollen bruker auxin og auxin-induserbart degron (AID) system for effektivt å tømme et mål protein.
The AID systemet har sin opprinnelse i planter, der en auxin (i denne protokollen indol-3-eddiksyre (IAA) brukes), stimulerer samspillet av Aux/IAA protein med TIR1, et medlem av SCF U3 ubiquitin ligase kompleks4. SCF kompleks interaksjon årsaker polyubiquitination av Aux/IAA familie proteiner, som resulterer i deres degradering av proteasomet5,6.
Dette systemet ble tidligere tilpasset for bruk i gjær Saccharomyces cerevisiae ved å uttrykke TIR1 protein fra Oriza sativa (osTIR) i gjærceller, der det er i stand til å samhandle med den endogene gjær SCF-komplekset. Proteinet av interesse ble merket med et motiv fra Aux/IAA protein IAA17 å målrette den for degradering. Funksjonell truncations av IAA17 ble utviklet senere, for eksempel hjelp *8,9,10, som inneholder 43 amino acid auxin-sensitive motiv fra Arabidopsis thaliana IAA17, sammen med en epitope kode for å aktivere Oppdagelsen.
Systemet i utgangspunktet tilpasset for bruk i spirende gjær7,8 uttrykt osTIR1 protein fra en gjær gal promoter. Expression krever skifte til vekstmedium med galaktose som eneste karbon kilde, som, dessverre, resulterer i en diauxic Skift med omfattende endringer i celle metabolisme11. På den annen side har det blitt rapportert at konstituerende uttrykk for TIR1 kan føre til degradering av mål proteinet i fravær av auxin/IAA12 hvis uttrykks nivået er høyt, mens lavt TIR1-uttrykk fører til ineffektiv tømming. En forbedret AID system kalt β-EST AID ble utviklet der osTIR er under kontroll av en induserbart promoter som er tunable for å passe målet protein, med minimal effekt på celle metabolisme. For å oppnå dette, en kunstig transkripsjon faktor (ATF) ble bygget der VP16 viral transkripsjon aktivator er smeltet til en østrogen reseptor og en fire ZN fingre DNA bindende domene (dbd). Når β-østradiol (en østrogen) er til stede, kan ATF gå inn i kjernen og indusere osTIR transkripsjon ved binding til sin promoter (Z4EVpr)13,12.
osTIR uttrykket er vanligvis oppdages ca 20 min etter tilsetning av β-østradiol12. Den optimale varigheten av osTIR-uttrykket for å oppnå effektiv tømming av det kodede proteinet med auxin, og samtidig unngå forringelse før auxin tillegg, må imidlertid empirisk bestemmes for hvert mål protein. En omtrentlig tid for denne pre-inkubasjons kan anslås fra overflod verdier i Saccharomyces Genova database (SGD https://www.yeastgenome.org/). Som kan sees i figur 1, det rike proteinet, Dcp1 (2880 til 4189 molekyler/celle), krever 40 min av pre-inkubasjons med β-østradiol, uten auxin-uavhengig forringelse observert. Den mye mindre rikelig protein, Prp2 (172 til 211 molekyler/celle), er sterkt utarmet etter bare 20 min av pre-inkubasjons. Det er tilrådelig å teste to ekstra inkubasjons ganger, 10 til 20 min før eller etter denne første estimerte tiden (20 min er den minste tiden som anbefales). Den optimale pre-inkubasjonstid er tiden der målet protein har ikke utarmet før du legger auxin og når auxin er lagt til tømming er akseptabelt eller proteinnivåer nærmer minimum mulig. Så, fra figur 1B, for Prp22 med 30 min av pre-inkubasjons, har nivåene ikke falt mye 10 min etter auxin tillegg. Sammenligning av dette med 40 min av pre-inkubasjons og 15 minutter med IAA, der det er lite ekstra forbruk, er det ingen fordel i incubating med auxin lenger enn 10 min eller pre-incubating i mer enn 30 min, særlig ettersom det er bevis for ikke-auxin forringelse ved 40 min. For Dcp1 med 40 min av pre-inkubasjons (det siste punktet hvor protein nivået er ca 100% før auxin tillegg), er 15 til 20 min av tømming med auxin akseptabelt. Det anbefales å holde nedbryting tid så kort som mulig for å redusere sekundære effekter på celle metabolisme14.
Denne artikkelen viser hvordan du bruker β-EST AID system ved å optimalisere tidspunktet for β-østradiol inkubasjons for osTIR uttrykk for å oppnå rask mål protein tømming på IAA tillegg uten slitasje før du legger auxin.
En godt optimalisert protokoll kan gi rask og effektiv tømming av mål proteinet. Fastsettelse av omtrentlig pre-inkubasjonstid med β-østradiol er viktig, da dette øker reproduserbarhet av tømming, men små variasjoner i pre-inkubasjonstid kan tolereres. På den annen side, må forsiktighet tas med timing etter auxin tillegg, som protein nivået avtar svært raskt.
En fordel med denne tilnærmingen er at innstilt tømming kan oppnås ved varierende kombinasjoner av pre-inkubasjonstid med β-østradiol og IAA inkubasjonstid. For eksempel, hvis ønskelig, kan mål proteinet bli langsommere utladet ved å redusere den inkubasjonstiden.
Β-EST AID systemet tilbyr visse fordeler fremfor systemer der OsTIR er constitutively uttrykt. Hvis for eksempel mål proteinet er avgjørende for levedyktighet, kan regulert uttrykk for osTIR unngå for tidlig tømming av mål proteinet. Videre kan uttrykk for osTIR være innstilt for å passe overflod av målet protein og dens mottakelighet for fornedrelse, og nedbryting kan være enten rask eller langsom. De to små molekylet effekt Orer, β-østradiol og auxin, ikke forurolige gjær metabolismen under de forholdene som brukes her, i motsetning Rapamycin, som brukes i ankeret-Away system1.
Det bør bemerkes at merking noen proteiner forstyrrer deres funksjon, som er et problem med noen målrettede nedbryting system. I dette tilfellet kan en N-Terminal kode fungere når en C-terminal-kode ikke. Dessuten vil ikke alle proteiner bli utarmet effektivt; for eksempel kan AID-tag på målet protein være utilgjengelig for osTIR protein. Derfor, etter AID-merking, bør hvert mål protein testes for enhver effekt av koden på vekst, og for å avgjøre om reduksjonen er effektiv, før tidsberegningen av β-østradiol pre-inkubasjons og auxin behandling er optimalisert.
Dette AID * systemet er svært enkel og er kompatibel med eventuelle etterfølgende eksperimentell prosedyre som ikke involverer videre vekst, slik som protein, DNA eller RNA analyse eller mikroskopi. I tillegg fungerer systemet godt når det kombineres med thiolabelling for å rense begynnende RNA20.
Dette systemet gir en rask, spesifikk og reproduserbar måte å tappe et protein uten å påvirke metabolismen av gjær cellen.
The authors have nothing to disclose.
Takk til Jane Reid for initiering av dette programmet, Barbara Terlouw for utvikling, Vahid Aslanzadeh for “ura looper” konstruerer og Susana de Lucas for mange nyttige diskusjoner. Dette arbeidet ble støttet av et stipend til GIMO fra Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, Mexico (CONACYT) og University of Edinburgh School of Biological Sciences, en Wellcome PhD studentship til IEM [105256] og ved Wellcome finansiering [104648] til JD Beggs . Arbeid i Wellcome senter for Cell Biology er støttet av Wellcome kjerne finansiering [092076].
Adenine sulphate | Formedium | DOC0230 | |
Agar | Formedium | AGA03 | |
Β-estradiol | Sigma Aldrich | E2758-1G | 10mM solution in ethanol. Store at -20 oC |
DMSO | Alfa Aesar | 42780 | DMSO should be solid at 4 oC |
Glucose | Fisher Scientific | G/0500/60 | |
IAA 1H-Indole-3-acetic acid | Across Orgainics | 122150100 | Auxin analogue. 1.5 M in DMSO. The solution will be a russet colour and darken as time goes on; a deep red solution should be discarded and a new one made. Store at -20 oC. |
Methanol | Fisher Scientific | M/4000/PC17 | CAUTION Toxic and flammable |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530 | |
Peptone | Formedium | PEP03 | |
SCSM single drop-out –ura | Formedium | DSCS101 | |
Yeast Extract | Formedium | YEA03 | |
Yeast nitrogen base without amino acids with amonium sulphate | Formedium | CYN0410 |