Denne artikkelen skisserer en enkel PCR-basert analyse for å overvåke aktiviteten til en aktiv LINE-1 retrotransposon og å kartlegge de Novo retrotranspositions i en gitt Genova. Ved hjelp av MCF7 cellelinjen, viser vi her hvordan denne metoden kan brukes til å oppdage aktiviteten til en linje-1 som ligger på 22q 12.1.
Long ispedd kjernefysiske elementer 1 (LINE-1s) er den eneste familien av mobile genetiske elementer i den menneskelige Genova som kan bevege seg selvstendig. De gjør det ved en prosess som kalles retrotransposition hvor de transkribere å danne en mRNA mellomliggende som deretter følgelig settes inn i Genova ved omvendt transkripsjon. Til tross for å være taus i normale celler, LINE-1s er svært aktive i ulike epitel svulster. De Novo LINE-1 innsettinger kan potensielt kjøre tumorigenesis, og dermed er det viktig å systematisk studere LINE-1 retrotransposition i kreft. Ut av ~ 150 retrotransposition-kompetent LINE-1s stede i den menneskelige Genova, bare en håndfull LINE-1 Loci, også referert til som “hot” LINE-1s, står for flertallet av de Novo line-1 innsetting i ulike krefttyper. Vi har utviklet en enkel polymerase kjedere reaksjon (PCR)-basert metode for å overvåke retrotransposition aktivitet i disse varme LINE-1s. Denne metoden, basert på langdistanse invers (LDI)-PCR, utnytter 3 ́ Transduction, en mekanisme der en linje-1 mobiliserer sin flankerer ikke-repeterende region, som senere kan brukes til å identifisere de Novo LINE-1 3 ́ Transduction hendelser som stammer fra en bestemt varm linje-1.
Long ispedd kjernefysiske elementer (LINE-1s) er en familie av mobile genetiske elementer kalt retrotransposons som kan uavhengig flytte fra ett sted til et annet via en kopi-og-lim mekanisme kalt retrotransposition. Over evolusjonære tid, har den menneskelige Genova akkumulert mer enn 500 000 eksemplarer av LINE-1 gjentar1. Imidlertid, det meste av linjen-1 eksemplarene gave inne det Genova er mutert og herav kan ikke bevege via retrotransposition; bare ~ 150 eksemplarer har intakt kopi av DNA-sekvensen er nødvendig for dem å flytte2. I normale somatiske celler, mobilitet av disse LINE-1s er begrenset av ulike vert faktorer3. Disse begrensningene er lettet i forskjellige epitel svulster, forårsaker LINE-1s skal derepressed og resulterer i mange de Novo innsettinger i svulsten Genova4. Noen av disse tumor-assosiert de Novo innsettinger har vist å forårsake insertional mutagenese i gener, derav kjører tumorprogresjon5,6. Derfor er det viktig å kunne kartlegge romanen innsettinger i svulsten Genova.
Eksisterende metoder for å oppdage de Novo line-1 innsettinger bruk (1) hele Genova sekvensering tilnærming4,7,8, der ulike beregningsorientert algoritmer brukes til å finne de Novo line-1 innsettinger fra WGS data, eller (2) neste generasjons sekvensering som er rettet mot 3 ́ slutten av unge, potensielt aktive linje-1s9,10,11,12,13. Men å finne romanen innsettinger blant flere tusen nær-identiske kopier med disse metodene er langt fra trivielt, og utfordringen er ytterligere forverret av tumor heterogenitet og genomisk endringer knyttet til linje-1 innsetting4.
Studier som bruker disse eksisterende metodene viste at bare noen få linje-1s står for flertallet av de Novo line-1 innsettinger observert i svulster7,8. Derfor, for å svare på om en bestemt tumor prøven viser LINE-1 aktivitet, er det nok å kartlegge retrotransposition hendelser forårsaket av denne håndfull svært aktive LINE-1 Loci. I denne artikkelen beskriver vi en enkel polymerase kjedere reaksjon (PCR)-basert metode14 som kan brukes til å overvåke aktiviteten til en bestemt linje-1-geometrisk i den første Intronets opprinnelse av TTC28 -genet ved 22q 12.1, som er svært aktiv i tykktarmskreft 7 andre er , 8. denne linjen-1 geometrisk vil bli referert til som TTC28-linje-1 i hele artikkelen. Denne analysen identifiserer spesielt de Novo line-1-retrotransposition hendelser som mobilisere ikke-repeterende sekvens på 3 ́ flankerer-regionen på kildelinjen-1 av en mekanisme kalt 3 ́ Transduction15. 3 ́ Transduction oppstår på grunn av den svake linjen-1 polyadenylation signal (PAS) som fører til at transcriptional maskiner til å hoppe over det og i stedet avslutte transkripsjon på sterkere PAS nedstrøms, og dermed fange flankerer ikke-repeterende sekvens ( heretter referert til som “unik tag”) som deretter settes inn i målplasseringen sammen med LINE-1 sekvensen. Philippe et al.16 nylig viste at ulike celletyper kan UTTRYKKE ulike line-1 Loci. I lys av dette funnet, kan denne metoden brukes til å overvåke aktiviteten til de mest uttrykte linje-1 som mobilisere deres unike koden i krefttype interesse.
Det første trinnet i LDI-PCR er fordøyelsen av genomisk DNA med et Begrensnings enzym som genererer en Begrensnings fragment som inneholder linje-1 som analyseres (her, TTC28-line-1) og dens unike kode (figur 1). Fordøyd DNA er deretter circularized av selv-ligation og PCR forsterket ved hjelp av inverse primere ligger innenfor den unike koden. Ved å gjøre dette, full-lengde kildelinje-1 på sitt “native” plassering er alltid forsterkes og sammen med det, avkom linje-1 innsettinger på ulike mål Loci som inneholder den unike koden vil også forsterkes (figur 1), og dermed rapportering retrotransposition aktivitet av LINE-1 i spørsmålet.
Her beskriver vi en metode som kan brukes til å identifisere de Novo line-1 innsettinger stammer fra alle aktive line-1 av interesse. Vi har optimalisert denne metoden for en svært aktiv LINE-1, som ligger på 22q 12.1, og tidligere vist det å være svært følsom i å oppdage sub-klonal innsettinger i tykktarmskreft14.
Suksessen til LDI-PCR avhenger av kvaliteten på genomisk DNA. Derfor har vi tatt med en ekstra kvalitetskontroll trinn for å sikre at ved starten av protokollen, høy molekylvekt DNA er til stede (trinn 2.1.2). Vi anbefaler at du oppbevarer genomisk DNA ved-20 ° c for langtidslagring, og for å forberede alikvoter for å unngå sykluser med frysing og tine. Bruke genomisk DNA fra blod eller pasient-matchet normalt vev er sterkt anbefalt å skille om LINE-1 retrotransposition oppdaget er en germline eller en somatiske hendelse. Siden kuttet nettsteder for begrensning enzymer er Stokastisk i Genova, er det mulig at en bestemt de Novo line-1 innsetting området kanskje ikke havna noen kutt nettsteder for begrensning enzymet brukes i nærheten. Derfor å øke sannsynligheten for å oppdage flertallet av de Novo line-1 innsettinger i tumor DNA, mer enn en restriksjon enzym bør brukes i separate reaksjoner for å generere ulike biblioteker av sirkulær DNA mal. Videre, hvis den unike koden på LINE-1 av interesse har mer enn én PAS, deretter bruke primer parene ved siden av hver PAS forbedrer sjansene for å oppdage sterkt avkortet transductions.
Selv om elegante metoder for Genova-bred deteksjon av de Novo line-1 innsettinger eksisterer, kan de være overveldende hvis målet er å undersøke retrotransposition kompetanse på en bestemt linje-1 i en bestemt cellulær kontekst. For dette formålet, LDI-PCR kan være en billig og enkel, men robust tilnærming for å visualisere LINE-1 retrotransposition hendelser. Målrettingsmetoden som brukes i denne fremgangsmåten, ligner på TS-ATLAS22. LDI-PCR unngår imidlertid å bruke linker oligonukleotider og kan forsterke både 5 ́ og 3 ́ kryss på de Novo line-1 innsetting samtidig. Informasjon om både 5 ́ og 3 ́ knutepunkter for linje-1-innsetting, målstedet for integrasjon, polyA hale og mål-site modifikasjoner, som alle er kjennetegnene på LINE-1 retrotransposition, kan fås ved kobling LDI-PCR med ett-molekyl lang-lese sekvensering teknologiene. Lange leser dermed generert inneholder satt LINE-1 sekvens, dens unike koden og målet sekvenser i en enkelt lese, omgå vanskeligheter med kartlegging korte leser i repeterende regionen.
Det er to store begrensninger ved bruk av LDI-PCR for påvisning av linje 1-aktivitet. Den første er iboende til PCR: det kan bare pålitelig forsterke fragmenter opp til 10 kB i størrelse. Dette bør vurderes ved valg av Begrensnings enzym (er), da det innfødte fragmentet ikke bør overskride denne grensen. For det andre kan denne metoden bare oppdage retrotransposition hendelser som mobilisere 1 ‘ s 3 ́ flankerer region av 3 ́ transductions. Derfor vil ikke aktiviteten til de LINE-1s som ikke viser 3 ́ Transduction bli oppdaget ved hjelp av denne metoden. I tillegg, til tross for å bli forsterket av LDI-PCR, noen linje-1 retrotransposition hendelser som (a) genererer et PCR-mål på tilsvarende størrelse som “native” sted eller andre retrotranspositions eller (b) er sjeldne eller subclonal, kan ikke oppdages av agarose gel elektroforese. Slike linje-1 retrotransposition hendelser kan fanges opp av sekvensering LDI-PCR-produktet ved hjelp av enkelt molekyl lang lese sekvensering teknologier14.
Arbeidsflyten beskrevet her kan enkelt endres for å oppdage aktiviteten til andre “hot” LINE-1s ved hjelp av en passende begrensning enzym og ved å designe inverse primere målretting disse LINE-1s. I tillegg til deteksjon av LINE-1 mediert 3 ́ Transduction, kan denne metoden tilpasses til å oppdage mindre hyppige linje-1 mediert 5 ́ transductions23. Lignende metode har blitt brukt til å identifisere integreringen området LINE-1 journalister i celle-baserte analyser24 og proviral integrering nettsteder i kreft25. I tillegg til linje-1 innsettinger, kan denne metoden også utnyttes til å oppdage andre genomisk avvik, som DNA rearrangements, der informasjon om omorganisering-liggende regionen pre-eksisterer26.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke alle våre co-forfattere i artikkelen der denne metoden ble først beskrevet14, spesielt Tatiana Cajuso, Kimmo Palin, outi Kilpivaara og ESA Pitkänen for verdifulle diskusjoner mens utvikle metoden. L.K. er finansiert av akademiet i Finland (gi nummer 25996, 292789, 306026 og 314394), Sigrid Juselius Foundation, og det finske Kreftforeningen. B.P. er mottaker av University of Helsinki Research Foundation PhD studentship, en finsk Cancer Society avhandling stipend, og en doktorgradsforskning stipend fra Ida Montinin Säätiö. Vi takker også Teemu Masalin (Universitetet i Helsingfors) og kul Shrestha fra L.K. forskningsgruppe for å hjelpe oss med video produksjon.
1 Kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232L | |
10 mM dNTP | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
Acetic acid | ThermoFisher Scientific | 64-19-7 | Used to make TAE buffer |
Agarose | BioNordika | BN-50004 | |
Blood sample (frozen) | Blood sample from a healthy individual for control PCR | ||
ChemiDoc XRS+ System | Bio-rad | 1708265 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | ThermoFisher Scientific | R0611 | |
DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69504 | |
Ethidium Bromide | Bio-rad | 161-0433 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher Scientific | 25102-12-9 | Used to make TAE buffer |
FastDigest buffer | ThermoFisher Scientific | B64 | |
FastDigest SacI | ThermoFisher Scientific | FD1133 | |
Generuler 1 Kb plus DNA Ladder | ThermoFisher Scientific | SM1331 | |
Generuler Lambda DNA/HindIII Marker, 2 | ThermoFisher Scientific | SM0103 | |
Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 1704406 | |
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F537L | |
PowerPac Basic Power Supply | Bio-rad | 1645050 | |
Quantus Fluorometer | Promega | E6150 | |
T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | EL0011 | |
Tear-A-Way 96/8, 96 Well PCR Plate | 4titude | 4ti-0750/TA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | ThermoFisher Scientific | 77-86-1 | Used to make TAE buffer |
Veriti Thermal Cycler | Applied Bioscience | 4375786 |