Analyse af lipid dråbe indhold i fission og spirende gær ved hjælp af automatiseret billedbehandling
Summary
Her præsenterer vi en MATLAB implementering af automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af lipid dråber i Fluorescens mikroskopi billeder af fission og spirende gærceller.
Abstract
Lipid metabolisme og dens regulering er af interesse for både grundlæggende og anvendt biovidenskab og bioteknologi. I denne forbindelse anvendes forskellige gærarter som modeller i lipid metaboliske forskning eller til industriel lipid produktion. Lipid dråber er meget dynamiske opbevarings organer og deres cellulære indhold repræsenterer en bekvem aflæsning af lipid metaboliske tilstand. Fluorescens mikroskopi er en metode til valg af kvantitativ analyse af cellulære lipid dråber, da den er afhængig af bredt tilgængeligt udstyr og giver mulighed for analyse af individuelle lipid dråber. Desuden kan mikroskopisk billedanalyse automatiseres, hvilket i høj grad øger den samlede analysekapacitet. Her beskriver vi en eksperimentel og analytisk arbejdsgang for automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af individuelle lipid dråber i tre forskellige model gærarter: fissions gær Schizosaccharomyces pombe og Schizosaccharomyces japonicus, og den spirende gær Saccharomyces cerevisiae. Lipid dråber visualiseret med BODIPY 493/503, og celle-impermeable fluorescerende dextran tilsættes til kultur medierne for at hjælpe med at identificere cellegrænser. Cellerne udsættes for 3D-epifluorescens mikroskopi i grønne og blå kanaler, og de resulterende z-stack-billeder behandles automatisk af en MATLAB-rørledning. Proceduren udsender rige kvantitative data om cellulære lipid dråbe indhold og individuelle lipid dråbe egenskaber i et tabelformat, der egner sig til downstream-analyser i større regneark eller statistiske pakker. Vi giver eksempel analyser af lipid dråbe indhold under forskellige forhold, der påvirker cellulære lipid metabolisme.
Introduction
Lipiderne spiller afgørende roller i cellulære energi og kulstof metabolisme, syntese af membran komponenter, og produktion af bioaktive stoffer. Lipid metabolisme er finjusteret i henhold til miljømæssige forhold, næringsstof tilgængelighed og celle-cyklus fase1. Hos mennesker, lipid metabolisme har været forbundet med sygdomme, såsom fedme, type II diabetes og kræft2. I industrien udgør lipider fremstillet af mikroorganismer, såsom gær, en lovende kilde til vedvarende dieselolie3. Cellerne lagrer neutrale lipiderne i såkaldte lipid-dråber (LDs). Disse evolutionært bevaret organer er sammensat af triacylglyceroler, steryl estere, en ydre phospholipid enkeltlags og tilhørende proteiner1. LDs har oprindelse i endoplasmatiske reticulum, udøver celle-cyklus eller vækst-fase dynamik, og er vigtige for cellulære lipid homøostase1. LD nummer og morfologi kan bruges som en bekvem proxy, når bestemmelse lipid metabolisme under forskellige vækstbetingelser eller når screening et panel af mutanter. I betragtning af deres dynamiske karakter, teknikker i stand til at analysere egenskaberne af de enkelte LDs er af særlig interesse i undersøgelser af lipid metabolisme.
Forskellige gærarter er blevet brugt til at beskrive lipid-relaterede metaboliske veje og deres regulering, eller anvendes i bioteknologi til at producere interessante forbindelser eller brændstoffer1. Endvidere, for model gær, såsom spirende gær Saccharomyces cerevisiae eller den fjernt relateret fission gær Schizosaccharomyces pombe, Genome-Wide sletning stamme biblioteker er tilgængelige, der kan bruges til high-gennemløb skærmbilleder4,5. For nylig ld sammensætning og dynamik er blevet beskrevet i S. pombe6,7,8,9, og mutanter relateret til lipid metabolisme er blevet isoleret i den spirende model gær Schizosaccharomyces japonicus10.
Der findes talrige teknikker til undersøgelse af LD-indhold og-dynamik. De fleste ansætte en form for farvning af LDs med lipofile farvestoffer såsom Nilen rød eller BODIPY 493/503. Sidstnævnte viser mere smalle excitation og emission spektre, og øget specificitet mod neutrale lipiderne (LDs) i modsætning til fosfolipider (membraner)11. Fluorimetriske og flow-cytometri metoder er blevet anvendt med succes i forskellige svampearter til at afdække gener og vækstbetingelser, der påvirker opbevaring lipid indhold12,13,14,15. Disse metoder egner sig til applikationer med høj kapacitet, men de kan ikke måle antallet og morfologien af individuelle LDs i celler, som kan variere dramatisk mellem vækstbetingelser og genotyper. Sammenhængende Raman spredning eller digital holografisk mikroskopi er label-fri metoder, der giver ld-niveau data, men kræver specialiseret dyrt udstyr16,17,18. Fluorescens mikroskopi, på den anden side, kan give detaljerede data om LD indhold, samtidig udnytte almindeligt tilgængelige instrumenter og billedanalyse software værktøjer. Flere analyse arbejdsgange findes, der har forskellige grader af raffinement og automatisering i celle/ld detektion fra billeddata, og er optimeret til forskellige celletyper, såsom metazoiske celler med store LDs19,20 , 21, eller spirende gær17,22,23. Nogle af disse tilgange virker kun i 2D (f. eks. på maksimale projektion billeder), som kan ikke pålideligt beskrive cellulært LD indhold. Til vores viden, findes der ingen værktøjer til bestemmelse af LD indhold og morfologi fra fission gær mikroskopiske data. Udvikling af automatiserede og robuste LD-niveau analyser vil give øget følsomhed og øget statistisk effekt, og give rig information om neutralt lipid indhold, ideelt i flere gærarter.
Vi har udviklet en arbejdsgang for LD-indholdsanalyse fra 3D Fluorescens mikroskopi billeder af gærceller. Levende celler er farvet med BODIPY 493/503 og Cascade Blue dextran at visualisere LDs og bestemme cellegrænser, hhv. Cellerne er immobiliseret på glas slides og udsat for z-stack Imaging ved hjælp af en standard epifluorescens mikroskop. Billeder behandles derefter af en automatiseret pipeline implementeret i MATLAB, en meget brugt (kommerciel) pakke til statistiske analyser. Pipelinen udfører billedforbehandling, segmentering (celler vs. baggrund, fjernelse af døde celler) og LD-identifikation. Fyldige data på LD-niveau, såsom LD-størrelse og fluorescens intensitet, leveres derefter i et tabelformat, der er kompatibelt med større regnearkssoftware værktøjer. Arbejdsprocessen blev brugt med succes til at bestemme virkningen af kvælstof kilde tilgængelighed på lipid metabolisme i S. pombe24. Vi demonstrerer nu funktionaliteten af arbejdsprocessen i s. pombe, s. japonicus og s. cerevisiaeved hjælp af vækstbetingelser eller mutanter, der påvirker cellulært LD-indhold.
Protocol
Representative Results
Discussion
Forståelsen af lipid metabolisme og dens regulering er vigtig for både grundlæggende biologi, og kliniske og bioteknologiske anvendelser. LD-indhold repræsenterer en bekvem aflæsning af lipid metabolisme tilstand af cellen, med Fluorescens mikroskopi er en af de vigtigste metoder, der anvendes til LD indhold bestemmelse. Den præsenterede protokol giver mulighed for automatiseret detektion og kvantitativ beskrivelse af individuelle LDs i tre forskellige og morfologisk adskilte gærarter. Til vores viden findes der i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Charles University Grants PRIMUS/MED/26, GAUK 1308217 og SVV 260310. Vi takker Ondřej Šebesta for hjælp med mikroskopi og udvikling af billedet analyse pipeline. Vi takker ReGenEx Lab for s. cerevisiae stammer, og Japonet og Hironori niki’s Lab for s. japonicus stammer. Ppc1-88 stammen blev leveret af gær genetiske ressource center Japan. Mikroskopi blev udført i laboratoriet for Konfokal-og Fluorescens mikroskopi, der var medfinansieret af den europæiske fond for regional udvikling og Den Tjekkiske Republiks statsbudget (projekt nr. CZ. 1,05/4.1.00/16.0347 og CZ. 2.16/3.1.00/21515).
Materials
| 12-bit monochromatic CCD camera Hamamatsu ORCA C4742-80-12AG | Hamamatsu | or equivalent | |
| Adenine hemisulfate salt, ≥99% | Merck | A9126-25G | |
| BODIPY 493/503 (4,4-Difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene) | Thermo Fisher Scientific | D3922 | for neutral lipid staining |
| D-(+) – Glucose, ≥99.5% | Merck | G7021 | |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | Thermo Fisher Scientific | D1976 | for negative staining of cells |
| Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% | Merck | D4540 | or higher purity, keep anhydrous on molecular sieves |
| EMM broth without dextrose | Formedium | PMD0405 | medium may also be prepared from individual components |
| Fiji/ImageJ software | NIH | or equivalent; for visual inspection of microscopic data | |
| High precision cover glasses, 22×22 mm, No 1.5 | VWR | 630-2186 | use any # 1.5 cover glass |
| Image Processing Toolbox for MATLAB, version 10.0 | Mathworks | ||
| Lectin from Glycine max (soybean) | Merck | L1395 | for cell immobilization on slides |
| MATLAB software, version 9.2 | Mathworks | ||
| Microscope slide, 26 x 76 mm, 1 mm thickness | Knittel Glass | L762601.2 | use any microscope slide fitting your microscope stage, clean thoroughly before loading cells |
| Olympus CellR microscope with automatic z-axis objective movement | Olympus | or equivalent | |
| pentaband filter set | Semrock | F66-985 | brightfield, green and blue channels are sufficient |
| Signal Processing Toolbox for MATLAB, version 7.4 | Mathworks | ||
| SP supplements | Formedium | PSU0101 | |
| standard office computer capable of running MATLAB | |||
| Statistics and Machine Learning Toolbox for MATLAB, version 11.1 | Mathworks | ||
| Universal peptone M66 for microbiology | Merck | 1070431000 | |
| UPLSAPO 60XO objective | Olympus | or equivalent | |
| Yeast extract | Formedium | YEA03 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | Formedium | CYN0405 |
Riferimenti
- Koch, B., Schmidt, C., Daum, G. Storage lipids of yeasts: a survey of nonpolar lipid metabolism in Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, and Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews. 38 (5), 892-915 (2014).
- Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. Balancing the fat: lipid droplets and human disease. EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).
- Lazar, Z., Liu, N., Stephanopoulos, G. Holistic Approaches in Lipid Production by Yarrowia lipolytica. Trends in Biotechnology. 36 (11), 1157-1170 (2018).
- Kim, D. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 1628-1629 (2010).
- Giaever, G., Nislow, C. The yeast deletion collection: a decade of functional genomics. Genetica. 197 (2), 451-465 (2014).
- Meyers, A., et al. The protein and neutral lipid composition of lipid droplets isolated from the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe. Journal of Microbiology (Seoul, Korea). 55 (2), 112-122 (2017).
- Meyers, A., et al. Lipid Droplets Form from Distinct Regions of the Cell in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe. Traffic (Copenhagen, Denmark). 17 (6), 657-659 (2016).
- Long, A. P., et al. Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast. Traffic (Copenhagen, Denmark). 13 (5), 705-714 (2012).
- Yang, H. J., Osakada, H., Kojidani, T., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. Lipid droplet dynamics during Schizosaccharomyces pombe sporulation and their role in spore survival. Biology Open. , 8 (2016).
- Aoki, K., Shiwa, Y., Takada, H., Yoshikawa, H., Niki, H. Regulation of nuclear envelope dynamics via APC/C is necessary for the progression of semi-open mitosis in Schizosaccharomyces japonicus. Genes To Cells: Devoted To Molecular & Cellular Mechanisms. 18 (9), 733-752 (2013).
- Karolin, J., Johansson, L. B. A., Strandberg, L., Ny, T. Fluorescence and Absorption Spectroscopic Properties of Dipyrrometheneboron Difluoride (BODIPY) Derivatives in Liquids, Lipid Membranes, and Proteins. Journal of the American Chemical Society. 116 (17), 7801-7806 (1994).
- Bozaquel-Morais, B. L., Madeira, J. B., Maya-Monteiro, C. M., Masuda, C. A., Montero-Lomeli, M. A new fluorescence-based method identifies protein phosphatases regulating lipid droplet metabolism. PloS One. 5 (10), e13692 (2010).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. Journal of Microbiological Methods. 91 (2), 321-328 (2012).
- Rostron, K. A., Lawrence, C. L. Nile Red Staining of Neutral Lipids in Yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1560, 219-229 (2017).
- Romero-Aguilar, L., Montero-Lomeli, M., Pardo, J. P., Guerra-Sánchez, G. Lipid Index Determination by Liquid Fluorescence Recovery in the Fungal Pathogen Ustilago Maydis. Journal of Visualized Experiments. (134), 1-6 (2018).
- Gupta, A., Dorlhiac, G. F., Streets, A. M. Quantitative imaging of lipid droplets in single cells. The Analyst. , (2018).
- Wolinski, H., Bredies, K., Kohlwein, S. D. Quantitative imaging of lipid metabolism in yeast: from 4D analysis to high content screens of mutant libraries. Methods in Cell Biology. , 108-365 (2012).
- Campos, V., Rappaz, B., Kuttler, F., Turcatti, G., Naveiras, O. High-throughput, nonperturbing quantification of lipid droplets with digital holographic microscopy. Journal of Lipid Research. 59 (7), 1301-1310 (2018).
- Ranall, M. V., Gabrielli, B. G., Gonda, T. J. High-content imaging of neutral lipid droplets with 1,6-diphenylhexatriene. BioTechniques. 51 (1), 35-42 (2011).
- Schnitzler, J. G., et al. Nile Red Quantifier: a novel and quantitative tool to study lipid accumulation in patient-derived circulating monocytes using confocal microscopy. Journal of Lipid Research. 58 (11), 2210-2219 (2017).
- Bombrun, M., Gao, H., Ranefall, P., Mejhert, N., Arner, P., Wählby, C. Quantitative high-content/high-throughput microscopy analysis of lipid droplets in subject-specific adipogenesis models. Cytometry. Part A the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (11), 1068-1077 (2017).
- Capus, A., Monnerat, M., Ribeiro, L. C., de Souza, W., Martins, J. L., Sant’Anna, C. Application of high-content image analysis for quantitatively estimating lipid accumulation in oleaginous yeasts with potential for use in biodiesel production. Bioresource Technology. 203, 309-317 (2016).
- Lv, X., et al. Identification of gene products that control lipid droplet size in yeast using a high-throughput quantitative image analysis. Biochimica et biophysica acta. Molecular and Cell Biology Of Lipids. 1864 (2), 113-127 (2018).
- Zach, R., Tvarůžková, J., Schätz, M., Ťupa, O., Grallert, B., Převorovský, M. Mitotic defects in fission yeast lipid metabolism “cut” mutants are suppressed by ammonium chloride. FEMS Yeast Research. 18 (6), 1-7 (2018).
- Petersen, J., Russell, P. Growth and the Environment of Schizosaccharomyces pombe. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (3), (2016).
- Aoki, K., Furuya, K., Niki, H. Schizosaccharomyces japonicus: A Distinct Dimorphic Yeast among the Fission Yeasts. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2017).
- Curran, B. P. G., Bugeja, V. Basic investigations in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , 1-14 (2014).
- Sabatinos, S. A., Forsburg, S. L. Molecular genetics of Schizosaccharomyces pombe. Methods in Enzymology. 470 (10), 759-795 (2010).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nakamura, T., Pluskal, T., Nakaseko, Y., Yanagida, M. Impaired coenzyme A synthesis in fission yeast causes defective mitosis, quiescence-exit failure, histone hypoacetylation and fragile DNA. Open Biology. 2 (9), 120117 (2012).
- Furuya, K., Niki, H. Isolation of heterothallic haploid and auxotrophic mutants of Schizosaccharomyces japonicus. Yeast. 26 (4), 221-233 (2009).
- Ivnitski-Steele, I., et al. Identification of Nile red as a fluorescent substrate of the Candida albicans ATP-binding cassette transporters Cdr1p and Cdr2p and the major facilitator superfamily transporter Mdr1p. Analytical Biochemistry. 394 (1), 87-91 (2009).
- Wolinski, H., Kohlwein, S. D. Microscopic analysis of lipid droplet metabolism and dynamics in yeast. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 457 (1), 151-163 (2008).
- Graml, V., et al. A genomic Multiprocess survey of machineries that control and link cell shape, microtubule organization, and cell-cycle progression. Developmental Cell. 31 (2), 227-239 (2014).
