Oncogenic जीन फ्यूजन जांच लंगर मल्टीप्लेक्स पॉलिमरेज चेन रिएक्शन का उपयोग अगली पीढ़ी अनुक्रमण द्वारा पीछा किया
Summary
यह लेख नैदानिक ठोस ट्यूमर के नमूनों में oncogenic जीन संलयन के लिए आकलन करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बाद एक लंगर मल्टीप्लेक्स पॉलिमरेज श्रृंखला प्रतिक्रिया आधारित पुस्तकालय तैयारी किट के उपयोग का विवरण। दोनों गीला बेंच और डेटा विश्लेषण कदम वर्णित हैं.
Abstract
जीन संलयन अक्सर कैंसर के कई अलग अलग प्रकार के oncogenic phenotype करने के लिए योगदान. इसके अतिरिक्त, कैंसर रोगियों से नमूनों में कुछ संलयन की उपस्थिति अक्सर सीधे निदान, पूर्वानुमान, और / नतीजतन, जीन संलयन का सही पता लगाने के कई रोग प्रकार के लिए नैदानिक प्रबंधन का एक महत्वपूर्ण घटक बन गया है. हाल ही में जब तक, नैदानिक जीन संलयन का पता लगाने मुख्य रूप से एकल जीन assays के उपयोग के माध्यम से पूरा किया गया था. तथापि, नैदानिक महत्व वाले जीन संलयनों की बढ़ती सूची ने एक साथ अनेक जीनों की संलयन स्थिति का आकलन करने की आवश्यकता पैदा कर दी है। अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS) आधारित परीक्षण बड़े पैमाने पर समानांतर फैशन में न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम करने की क्षमता के माध्यम से इस मांग को पूरा किया है. एकाधिक NGS आधारित दृष्टिकोण है कि जीन लक्ष्य संवर्धन के लिए विभिन्न रणनीतियों को रोजगार अब नैदानिक आणविक निदान में उपयोग के लिए उपलब्ध हैं, अपनी शक्तियों और कमजोरियों के साथ प्रत्येक. यह लेख नैदानिक ठोस ट्यूमर नमूनों में जीन संलयन के लिए आकलन करने के लिए एनजीएस द्वारा पीछा करने के बाद लंगर वाले मल्टीप्लेक्स पीसीआर (एएमपी) आधारित लक्ष्य संवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी के उपयोग का वर्णन करता है। एएमपी में amplicon आधारित संवर्धन दृष्टिकोण के बीच अद्वितीय है कि यह जीन संलयन की पहचान की परवाह किए बिना जीन संलयन की पहचान करता है. यहाँ विस्तृत दोनों गीला बेंच और डेटा विश्लेषण कदम है कि नैदानिक नमूनों से सटीक जीन संलयन का पता लगाने सुनिश्चित कर रहे हैं.
Introduction
एक एकल प्रतिलिपित्मक इकाई में दो या अधिक जीनों का संलयन हटाने, दोहराव, प्रविष्टि, व्युत्क्रमण, और translocations सहित बड़े पैमाने पर गुणसूत्र विविधताओं के परिणाम के रूप में हो सकता है। व्यक्त जीन उत्पाद के परिवर्तित प्रतिलेखनीय नियंत्रण और/अथवा परिवर्तित कार्यात्मक गुणों के माध्यम से ये संलयन जीन कैंसर कोशिकाओं को कोजनी गुणों को प्रदान कर सकते हैं1. कई मामलों में, संलयन जीन सीधे सेलुलर प्रसार और अस्तित्व के रास्ते को सक्रिय करके प्राथमिक oncogenic ड्राइवरों के रूप में कार्य करने के लिए जाना जाता है।
कैंसर रोगियों के लिए जीन संलयन की नैदानिक प्रासंगिकता पहले फिलाडेल्फिया गुणसूत्र और पुरानी माइलोजेनस ल्यूकेमिया (सीएमएल)2में इसी बीसीआर-ABL1 संलयन जीन की खोज के साथ स्पष्ट हो गया। छोटे अणु अवरोधक imatinib mesylate विशेष रूप से इस संलयन जीन को लक्षित करने के लिए विकसित किया गया था और बीसीआर-ABL1सकारात्मक सीएमएल रोगियों में उल्लेखनीय प्रभावकारिता का प्रदर्शन3. ओकोजेनिक जीन संलयनों का चिकित्सीय लक्ष्य भी ठोस ट्यूमर में सफल रहा है, गैर-छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर में ALK और ROS1 संलयन जीन ों के निषेध के साथ प्राथमिक उदाहरण4,5के रूप में सेवा कर रहे हैं। हाल ही में, NTRK अवरोधक larotrectinib एफडीए NTRK1/2/3 संलयन सकारात्मक ठोस ट्यूमर के लिए मंजूरी दे दी थी, रोग साइट6की परवाह किए बिना. चिकित्सा चयन के अलावा, जीन संलयन का पता लगाने भी रोग निदान और रोग का निदान में भूमिका है. यह विशेष रूप से विभिन्न सार्कोमा और हेमेटोलॉजिक द्रोह उपप्रकारों में प्रचलित है जो नैदानिक रूप से विशिष्ट संलयनोंकी उपस्थिति द्वारा परिभाषित किए जाते हैं और/या जिसके लिए संलयन की उपस्थिति सीधे पूर्वानुमान 7,8 को सूचित करती है , 9 , 10 , 11ये कैंसर रोगियों के लिए जीन संलयन का पता लगाने के नैदानिक अनुप्रयोग के कुछ उदाहरण हैं .
नैदानिक निर्णय लेने में महत्वपूर्ण भूमिका के कारण, नैदानिक नमूनों से सटीक जीन संलयन का पता लगाने के महत्वपूर्ण महत्व का है. कई तकनीकों संलयन या गुणसूत्र पुनर्व्यवस्थित विश्लेषण के लिए नैदानिक प्रयोगशालाओं में लागू किया गया है सहित: साइटोजेनेटिक तकनीक, रिवर्स प्रतिलेखन polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (आरटी-पीसीआर), situ संकरीकरण में फ्लोरोसेंट (FISH), इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), और 5’/3′ अभिव्यक्ति असंतुलन विश्लेषण (दूसरों के बीच)12,13,14,15. वर्तमान में, कैंसर में कार्रवाई योग्य जीन संलयनों की तेजी से विस्तार सूची के परिणामस्वरूप एक साथ कई जीनों की संलयन स्थिति का आकलन करने की आवश्यकता हुई है। नतीजतन, कुछ पारंपरिक तकनीक है कि केवल एक समय में एक या कुछ जीन क्वेरी कर सकते हैं अक्षम दृष्टिकोण होते जा रहे हैं, खासकर जब विचार है कि नैदानिक ट्यूमर के नमूने अक्सर बहुत सीमित हैं और कई परख के बीच विभाजित किया जा रहा करने के लिए अनुकूल नहीं है. अगली पीढ़ी अनुक्रमण (NGS), तथापि, एक विश्लेषण मंच है कि अच्छी तरह से बहु जीन परीक्षण के लिए अनुकूल है, और NGS आधारित परख नैदानिक आणविक नैदानिक प्रयोगशालाओं में आम हो गए हैं.
वर्तमान में उपयोग किए गए संलयन/पुनर्व्यवस्था का पता लगाने के लिए एनजीएस परख का उपयोग इनपुट सामग्री के संबंध में भिन्न होता है, पुस्तकालय तैयारी और लक्ष्य संवर्धन के लिए नियोजित रसायनज्ञ, और एक परख के भीतर पूछे जाने वाले जीनों की संख्या। NGS परख आरएनए या डीएनए (या दोनों) नमूने से निकाले पर आधारित हो सकता है. हालांकि आरएनए आधारित विश्लेषण अत्यधिक अवक्रमित आरएनए को रोकने के लिए नैदानिक नमूनों की प्रवृत्ति से बाधित है, यह डीएनए आधारित संलयन परीक्षण के लक्ष्य हैं कि बड़े और अक्सर दोहराव introns अनुक्रम की जरूरत को दरकिनार लेकिन NGS के लिए मुश्किल साबित हो गया है डेटा विश्लेषण16| आरएनए आधारित एनजीएस परख के लिए लक्ष्य संवर्धन रणनीतियों को काफी हद तक हाइब्रिड कैप्चर या एम्प्लिकॉन-मध्यस्थ दृष्टिकोणों में विभाजित किया जा सकता है। जबकि दोनों रणनीतियों को संलयन का पता लगाने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है , प्रत्येक अन्य17,18से अधिक लाभ शामिल हैं . हाइब्रिड कब्जा परख आम तौर पर अधिक जटिल पुस्तकालयों में परिणाम और एलीलिक ड्रॉपआउट कम है, जबकि amplicon आधारित परख आम तौर पर कम इनपुट की आवश्यकता होती है और कम ऑफ-लक्ष्य अनुक्रमण19में परिणाम. हालांकि, शायद पारंपरिक amplicon आधारित संवर्धन की प्राथमिक सीमा सभी ज्ञात संलयन भागीदारों के लिए प्राइमर के लिए की जरूरत है. यह समस्याग्रस्त है क्योंकि कई चिकित्सकीय महत्वपूर्ण जीन विभिन्न भागीदारों के दर्जनों के साथ फ्यूज करने के लिए जाना जाता है, और यहां तक कि अगर प्राइमर डिजाइन सभी ज्ञात भागीदारों का पता लगाने के लिए अनुमति दी, उपन्यास संलयन घटनाओं का पता नहीं चल रहेगा. हाल ही में वर्णित एक तकनीक जिसे एंकर्ड मल्टीप्लेक्स पीसीआर (या कम के लिए एएमपी) कहा जाता है, इस सीमाको 20को संबोधित करती है। एएमपी में, एक ‘आधा कार्यात्मक’ NGS एडाप्टर cDNA टुकड़े कि इनपुट आरएनए से प्राप्त कर रहे हैं करने के लिए ligated है. लक्ष्य संवर्धन जीन विशिष्ट प्राइमर और एडाप्टर के लिए एक प्राइमर के बीच प्रवर्धन द्वारा हासिल की है. परिणामस्वरूप, रुचि के जीनों के लिए सभी संलयन, भले ही एक उपन्यास संलयन साथी शामिल है, का पता लगाया जाना चाहिए (चित्र 1देखें)। यह लेख ArcherDx FusionPlex ठोस ट्यूमर किट, एक NGS आधारित परख है कि लक्ष्य संवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी के लिए एएमपी को रोजगार के उपयोग का वर्णन करता है, ठोस ट्यूमर के नमूनों में oncogenic जीन संलयन का पता लगाने के लिए (देखें अनुपूरक तालिका 1 के लिए पूर्ण जीन सूची). गीला बेंच प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण कदम कड़ाई से एक नैदानिक प्रयोगशाला सुधार संशोधन (CLIA) प्रमाणित प्रयोगशाला में मान्य किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
लंगर वाले मल्टीप्लेक्स पीसीआर-आधारित लक्ष्य संवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के बाद नैदानिक ट्यूमर के नमूनों में मल्टीप्लेक्स जीन संलयन मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कोलोराडो विश्वविद्यालय के आणविक पैथोलॉजी साझा संसाधन द्वारा समर्थित किया गया था (राष्ट्रीय कैंसर संस्थान कैंसर केंद्र सहायता अनुदान नहीं. P30-CA046934) और निजीकृत चिकित्सा के लिए कोलोराडो केंद्र द्वारा.
Materials
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
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