Detecção de fusão gênica oncogênica usando a reação em cadeia de polimerase multiplex ancorada seguida por sequenciamento da próxima geração

Summary

Este artigo detalha o uso de um kit de preparação de biblioteca com base em reação em cadeia do polymerase multiplex seguido de sequenciamento de próxima geração para avaliar as fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos clínicos. As etapas de análise de dados e de bancada úmida são descritas.

Abstract

As fusões do gene contribuem freqüentemente ao phenotype oncogênico de muitos tipos diferentes de cancro. Adicionalmente, a presença de certas fusões em amostras de pacientes oncológicos muitas vezes influencia diretamente o diagnóstico, o prognóstico e/ou a seleção da terapia. Em conseqüência, a deteção exata de fusões do gene transformou-se um componente crítico da gerência clínica para muitos tipos da doença. Até recentemente, a deteção clínica da fusão do gene foi realizada predominante com o uso de ensaios do único-gene. No entanto, a lista cada vez maior de fusões de genes com significância clínica criou uma necessidade de avaliar o status de fusão de múltiplos gene simultaneamente. Os testes baseados em sequenciamento da próxima geração (NGS) atenderam a essa demanda através da capacidade de sequenciar o ácido nucleico de forma massivamente paralela. Várias abordagens baseadas em NGS que empregam diferentes estratégias para o enriquecimento de alvos de genes estão agora disponíveis para uso em diagnósticos moleculares clínicos, cada um com seus próprios pontos fortes e fracos. Este artigo descreve o uso do enriquecimento do alvo do multiplex da PCR (ampère)-baseado ancorado e da preparação da biblioteca seguidos por NGS para avaliar para fusões do gene em espécimes contínuos clínicos do tumor. O AMP é único entre abordagens de enriquecimento baseadas em amplicon, pois identifica fusões genéticas, independentemente da identidade do parceiro de fusão. Detalhado aqui estão as etapas da análise do molhado-banco e de dados que asseguram a deteção exata da fusão de gene das amostras clínicas.

Introduction

A fusão de dois ou mais genes em uma única entidade transcricional pode ocorrer como o resultado de variações cromossomáticas da grande escala que incluem deleções, duplicações, inserções, Inversions, e translocations. Por meio do controle transcricional alterado e/ou das propriedades funcionais alteradas do produto genético expresso, esses genes de fusão podem conferir propriedades oncogênicas a células cancerosas¹. Em muitos casos, os genes da fusão são sabidos para actuar como excitadores oncogênico preliminares ativando diretamente a proliferação celular e as vias de sobrevivência.

A relevância clínica de fusões do gene para pacientes de cancro tornou-se primeiramente aparente com a descoberta do cromossoma de Philadelphfia e do gene correspondente da fusão BCR-ABL1 na leucemia Myelogenous crônica (CML)². O mesylate pequeno do imatinib do inibidor da molécula foi desenvolvido para alvejar especificamente este gene da fusão e demonstrou a eficácia notável em pacientes BCR-ABL1-positivos de CML³. A segmentação terapêutica de fusões genéticas oncogênicas também tem sido bem-sucedida em tumores sólidos, com inibição de genes de fusão ALK e ROS1 em câncer de pulmão de células não pequenas servindo como exemplos primários^4,5. Recentemente, o inibidor de NTRK larotrectinib foi aprovado pela FDA para tumores sólidos NTRK1/2/3 Fusion-positive, independentemente do local da doença⁶. Além da seleção da terapia, a deteção da fusão de gene igualmente tem papéis no diagnóstico e no prognóstico da doença. Isto é particularmente prevalente em vários sarcoma e subtipos de malignidade hematológica que são diagnosticticamente definidos pela presença de fusões específicas e/ou para que a presença de uma fusão informa diretamente o prognóstico^{7,8 , 9} anos de ^{, 10} de ^{, 11}. These são mas alguns dos exemplos da aplicação clínica da deteção da fusão genética para pacientes de cancro.

Devido ao papel crítico na tomada de decisão clínica, a deteção exata da fusão de gene das amostras clínicas é da importância vital. As técnicas numerosas foram aplicadas em laboratórios clínicos para a fusão ou a análise cromossomática do rearranjo que incluem: Técnicas citogénicas, reacção em cadeia reversa da polimerase da transcrição (RT-PCR), hibridação in situ da fluorescência (peixes), imunohistoquímica (IHC) e análise de desequilíbrio de expressão 5 ‘/3 ‘ (entre outros)^12,13,14,15. Presentemente, a lista ràpida de expansão de fusões de gene acionáveis no cancro conduziu à necessidade de avaliar simultaneamente o status da fusão de genes múltiplos. Conseqüentemente, algumas técnicas tradicionais que só podem consultar um ou alguns genes de cada vez estão se tornando abordagens ineficientes, especialmente quando se considera que as amostras de tumores clínicos são muitas vezes muito finitas e não são amáveis para serem divididas entre vários ensaios. O sequenciamento da próxima geração (NGS), no entanto, é uma plataforma de análise que é bem adequada para testes de múltiplos genes, e os ensaios baseados em NGS tornaram-se comuns em laboratórios clínicos de diagnóstico molecular.

Os ensaios de NGS usados atualmente para a detecção de fusão/rearranjo variam em relação ao material de entrada utilizado, às químicas empregadas para preparação da biblioteca e ao enriquecimento alvo, e ao número de genes consultados dentro de um ensaio. Os ensaios de NGS podem ser baseados em RNA ou DNA (ou ambos) extraídos da amostra. Embora a análise RNA-baseada seja dificultada pela tendência de amostras clínicas para conter o RNA altamente degradado, contorna a necessidade de sequenciar os íntrons grandes e frequentemente repetitivos que são os alvos do teste DNA-baseado da fusão mas provaram ser difíceis para NGS análise de dados¹⁶. Estratégias de enriquecimento alvo para ensaios de NGS baseados em RNA podem ser amplamente divididas em abordagens de captura híbrida ou mediadas por amplicon. Embora ambas as estratégias tenham sido utilizadas com sucesso para a detecção de fusão, cada uma delas contém vantagens sobre os outros^17,18. Os ensaios de captura híbrida geralmente resultam em bibliotecas mais complexas e reduziram o abandono alélico, enquanto os ensaios baseados em amplicon geralmente exigem uma entrada mais baixa e resultam em menos seqüenciamento fora do alvo¹⁹. No entanto, talvez a principal limitação do enriquecimento tradicional baseado em amplicon seja a necessidade de primers para todos os parceiros de fusão conhecidos. Isto é problemático, uma vez que muitos genes clinicamente importantes são conhecidos por fundir-se com dezenas de parceiros diferentes, e mesmo se o design da cartilha permitiu a detecção de todos os parceiros conhecidos, novos eventos de fusão permaneceria sem ser detectado. Uma técnica recentemente descrita denominada PCR multiplex ancorada (ou AMP para abreviação) aborda essa limitação²⁰. No AMP, um adaptador NGS ‘ semifuncional ‘ é ligado a fragmentos de cDNA que são derivados do RNA de entrada. O enriquecimento do alvo é conseguido pela amplificação entre primers específicos do gene e uma primeira demão ao adaptador. Como resultado, todas as fusões de genes de interesse, mesmo que um novo parceiro de fusão esteja envolvida, devem ser detectadas (ver Figura 1). Este artigo descreve o uso do kit ArcherDx FusionPlex Solid tumor, um ensaio baseado em NGS que emprega AMP para o enriquecimento alvo e preparação da biblioteca, para a detecção de fusões de genes oncogênicos em amostras de tumores sólidos (ver tabela complementar 1 para lista completa de genes). O protocolo de bancada úmida e as etapas de análise de dados foram rigorosamente validadas em um laboratório com certificação de alterações clínicas de melhoramento laboratorial (CLIA).

Protocol

1. preparação e sequenciamento de bibliotecas Considerações gerais sobre o ensaio e etapas de pré-ensaio As funcionamentos do ensaio consistem tipicamente em sete amostras clínicas e em um controle positivo (embora o número de amostras por a execução da preparação da biblioteca possa ser ajustado como necessário). Use um controle positivo que contenha pelo menos diversas fusões genéticas (que os alvos do ensaio) que foram confirmados por um fabricante e/ou tenham sido co…

Representative Results

Mostrado na Figura 3, figura 4 e Figura 5 são capturas de tela da interface de usuário de análise demonstrando resultados de uma amostra de adenocarcinoma de pulmão. Na Figura 3, o resumo da amostra é mostrado (superior) que lista as fusões de evidência fortes chamadas, bem como o status de QC (circulado em vermelho). A fusão de ADCK4-numbl (de que 3 isoformas é alistada) é ignorada i…

Discussion

O enriquecimento de alvo baseado em PCR multiplex e a preparação da biblioteca seguidos por sequenciamento de próxima geração são adequados para a avaliação de fusão genética multiplexada em amostras de tumores clínicos. Focalizando na entrada do RNA um pouco do que o ADN genomic, a necessidade de sequenciar íntrons grandes e repetitivos é evitada. Adicionalmente, desde que esta aproximação amplifica fusões do gene não obstante a identidade do sócio da fusão, as fusões novas são detectadas. Esta é u…

Materials

10 mM Tris HCl pH 8.0	IDT	11-05-01-13	Used for TNA dilution
1M Tris pH 7.0	Thermo Fisher	AM9850G	Used in library pooling
25 mL Reagent Reservoir with divider	USA Scientific	9173-2000	For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes
96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural	USA Scientific	1402-9700	Plate used for thermocycler steps
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	Used in purification after several assay steps
Agencourt Formapure Kit	Beckman Coulter	A33343	Used in TNA extraction
Archer FusionPlex Solid Tumor kit	ArcherDX	AB0005	This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)
Cold block, 96-well	Light Labs	A7079	Used for keeping samples chilled at various steps
Ethanol	Decon Labs	DSP-MD.43	Used for bead washes
Library Quantification for Illumina Internal Control Standard	Kapa Biosystems	KK4906	Used for library quantitation
Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix	Kapa Biosystems	KK4973	Used for library quantitation
Library Quantification Standards	Kapa Biosystems	KK4903	Used for library quantitation
Magnet Plate, 96-well (N38 grade)	Alpaqua	A32782	Used in bead purificiation steps
MBC Adapters Set B	ArcherDX	AK0016-48	Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing
Micro Centrifuge	USA Scientific	2641-0016	Used for spinning down PCR tubes
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate	Thermo-Fisher	4483485	Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
Microamp Optical Film Compression Pad	Applied Biosystems	4312639	Used for library quantitation
Mini Plate Spinner	Labnet	MPS-1000	Used for collecing liquid at bottom of plate wells
MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle)	Illumina	MS-102-3003	Contains components necessary for a MiSeq sequencing run
MiSeqDx System	Illumina		NGS Sequencing Instrument
Model 9700 Thermocycler	Applied Biosystems		Used for several steps during assay
nuclease free water	Ambion	9938	Used as general diluent
Optical ABI 96-well PCR plate covers	Thermo-Fisher	4311971	Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
PCR Workstation Model 600	Air Clean Systems	BZ10119636	Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box'
Proteinase K	Qiagen	1019499	Used in TNA extraction
QuantStudio 5	Applied Biosystems	LSA28139	qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation
Qubit RNA HS Assay Kit	Life Technologies	Q32855	Use for determing RNA concentration in TNA samples
RNase Away	Fisher	12-402-178	Used for general RNase decontamination of work areas
Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2	SeraCare	0710-0129	Used as the assay positive control
Sodium Hydroxide	Fisher	BP359-212	Used in clean-up steps and for sequencing setup
SYBR Green Supermix	Bio Rad	172-5120	Component of PreSeq QC Assay
TempAssure PCR 8-tube Strips	USA Scientific	1402-2700	Used for reagent and sample mixing etc.
Template RT PCR film	USA Scientific	2921-7800	Used for covering 96-well plates
U-Bottom 96-well Microplate	LSP	MP8117-R	Used during bead purification