Tumorsphere avledning og behandling fra primære tumor celler isolert fra mus Rhabdomyosarcomas
Summary
Denne protokollen beskriver en reproduserbar metode for isolering av mus rhabdomyosarcoma primære celler, tumorsphere dannelse og behandling, og allograft transplantasjon fra tumorspheres kulturer.
Abstract
Rhabdomyosarcoma (RMS) er den vanligste bløtvevet sarkom hos barn. Selv om betydelig innsats har aktivert identifisering av vanlige mutasjoner knyttet til RMS og tillot diskriminering av ulike RMS undergrupper, store utfordringer fortsatt eksisterer for utvikling av romanen behandlinger for å ytterligere forbedre prognosen. Selv identifisert av uttrykk for myogenic markører, er det fortsatt betydelig uenighet om RMS har myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, som cellen av opprinnelse er fortsatt dårlig forstått. I denne studien, en pålitelig metode er gitt for tumorsphere analysen for mus RMS. Analysen er basert på funksjonelle egenskaper av tumorceller og tillater identifisering av sjeldne populasjoner i tumor med tumorigene funksjoner. Også beskrevet er prosedyrer for å teste rekombinant proteiner, integrere transfeksjoner protokoller med tumorsphere analysen, og evaluere kandidat gener involvert i tumor utvikling og vekst. Beskrevet videre er en prosedyre for allograft transplantasjon av tumorspheres i mottaker mus for å validere tumorigene funksjon in vivo. Samlet, den beskrevne metoden gir pålitelig identifisering og testing av sjeldne RMS tumorigene populasjoner som kan brukes til RMS som oppstår i ulike sammenhenger. Endelig kan protokollen benyttes som en plattform for narkotika screening og fremtidig utvikling av legemiddel.
Introduction
Kreft er en heterogen sykdom; Videre kan samme type svulst presentere ulike genetiske mutasjoner i ulike pasienter, og innenfor en pasient en svulst er sammensatt av flere populasjoner av celler1. Heterogenitet presenterer en utfordring i identifisering av celler ansvarlig for initiering og spre kreft, men deres karakterisering er avgjørende for utviklingen av effektive behandlinger. Oppfatningen av tumor spre celler (TPC), en sjelden befolkning av celler som bidrar til tumor utvikling, har vært tidligere grundig gjennomgått2. Til tross for det faktum at TPCs har vært preget i flere typer kreft, er identifisering av markører for deres pålitelig isolasjon en utfordring for flere tumor typer3,4,5,6 , 7 andre er , 8 på alle , 9. således, en metode som ikke er avhengig av molekylære markører, men heller på TPC funksjonelle egenskaper (høy selv-fornyelse og evnen til å vokse i lav-vedlegg forhold), kjent som tumorsphere formasjon analysen, kan bli mye brukt for identifisering av TPCs fra de fleste svulster. Viktigere, kan denne analysen også være ansatt for utvidelse av TPCs og dermed direkte brukt til kreft narkotika screening og studier på kreft resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er en sjelden form for bløtvev sarkom mest vanlig i små barn11. Promodell RMS kan histologisk identifisert gjennom vurdering av uttrykk for myogenic markører, RMS-cellen av opprinnelse har ikke blitt univocally preget på grunn av flere tumor undergrupper og høy heterogenitet av tumor utviklingsmessige stimuli. Faktisk har nyere studier generert betydelige vitenskapelige diskusjonen om RMS er av myogenic eller ikke-myogenic opprinnelse, noe som tyder på at RMS kan utledes fra ulike celler typer avhengig av sammenhengen12,13, 14 priser og priser , 15 priser og , 16 flere , 17. Tallrike studier på RMS cellelinjer har blitt utført ansette tumorsphere formasjon analysen for identifisering av trasé involvert i tumor utvikling og karakterisering av markører forbundet med svært selv-fornyelse populasjoner 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 21i denne.
Men til tross for tumorsphere dannelse analysen potensial for å identifisere RMS celler opprinnelse, en pålitelig metode som kan brukes på primære RMS celler har ennå ikke blitt beskrevet. I denne sammenheng, en fersk studie fra vår gruppe ansatt en optimalisert tumorsphere formasjon analysen for identifisering av RMS-cellene opprinnelse i en Duchenne muskuløse dystrofi (DMD) mus modell22. Flere pre-tumorigene celletyper, isolert fra muskel vev, er testet for deres evne til å vokse i lav-vedlegg forhold, slik at identifisering av muskel stamceller som Opprinnelses celler for RMS i dystrophic sammenhenger. Beskrevet her er en reproduserbar og pålitelig protokoll for tumorsphere formasjon analysen (figur 1), som har blitt ansatt for identifisering av ekstremt sjeldne celle populasjoner som er ansvarlig for musen RMS utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere metoder har vært ansatt for isolasjon og karakterisering av TPCs fra tumor heterogene celle populasjoner: tumor clonogenic analyser, FACS isolasjon, og tumorsphere dannelse analysen. Svulsten clonogenic analysen ble først beskrevet i 1971, brukes for stilk cellen studier, og bare senere brukes til kreft biologi29,30. Denne metoden er basert på kreft stamceller iboende eiendom for å utvide uten begrensninger i myke gels kulturer31…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Ellison Medical Foundation stipend AG-NS-0843-11, og NIH pilot Grant innenfor NCI Cancer Center support Grant P30CA030199 til A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
Riferimenti
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Ricerca sul cancro. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Ricerca sul cancro. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
