Tumorsphere Afberegning og behandling fra primære tumor celler isoleret fra mus Rhabdomyosarcomas
Summary
Denne protokol beskriver en reproducerbar metode til isolering af mus rabdomyosarkom primære celler, tumorsphere dannelse og behandling, og allograft transplantation startende fra tumorspheres kulturer.
Abstract
Rhabdomyosarcoma (RMS) er den mest almindeligt forekommende bløddelssarkom hos børn. Selv om en betydelig indsats har gjort det muligt at identificere fælles mutationer forbundet med RMS og tilladt diskrimination af forskellige RMS-undertyper, er der stadig store udfordringer for udviklingen af nye behandlinger for yderligere at forbedre prognosen. Selv om det identificeres ved ekspression af myogene markører, der er stadig betydelig kontrovers om, hvorvidt RMS har myogene eller ikke-myogene oprindelse, som cellen af oprindelse er stadig dårligt forstået. I nærværende undersøgelse, en pålidelig metode er fastsat for tumorsphere assay for mus RMS. Analysen er baseret på funktionelle egenskaber af tumorceller og gør det muligt at identificere sjældne populationer i tumoren med tumorigent funktioner. Også beskrevet er procedurer for afprøvning af rekombinante proteiner, integrere transfektering protokoller med tumorsphere assay, og evaluere kandidat gener involveret i tumor udvikling og vækst. Beskrevet yderligere er en procedure for allograft transplantation af tumorspheres til recipient mus for at validere tumorigent funktion in vivo. Samlet set giver den beskrevne metode pålidelig identifikation og afprøvning af sjældne RMS tumorigent populationer, der kan anvendes til RMS opstår i forskellige sammenhænge. Endelig kan protokollen udnyttes som en platform for narkotika screening og fremtidig udvikling af Therapeutics.
Introduction
Kræft er en heterogen sygdom; Endvidere, den samme type af tumor kan præsentere forskellige genetiske mutationer i forskellige patienter, og inden for en patient en tumor er sammensat af flere populationer af celler1. Heterogenitet udgør en udfordring i identifikationen af celler, der er ansvarlige for initiering og formerings kræft, men deres karakterisering er afgørende for udviklingen af effektive behandlinger. Begrebet tumor formerings celler (TPC), en sjælden population af celler, der bidrager til tumor udvikling, er tidligere blevet grundigt gennemgået2. Trods det faktum, at tpcs har været karakteriseret i flere typer af kræft, identifikation af markører for deres pålidelige isolation er fortsat en udfordring for flere tumortyper3,4,5,6 , 7 , 8 , 9. derfor kan en metode, der ikke er baseret på molekylære markører, men snarere på TPC funktionelle egenskaber (høj selvfornyelse og evnen til at vokse i lav-fastgørelses forhold), kendt som tumorsphere formation assay, anvendes bredt til identifikation af TPCs fra de fleste tumorer. Vigtigere, denne analyse kan også anvendes til udvidelse af tpcs og dermed direkte anvendt til kræft Drug screening og undersøgelser af kræft resistens1,10.
Rhabdomyosarcoma (RMS) er en sjælden form for bløddelssarkom mest almindeligt hos små børn11. Althoug RMS kan histologisk identificeres gennem vurdering af ekspression af myogene markører, den RMS celle af oprindelse har ikke været enslydeligt karakteriseret på grund af de mange tumor undertyper og høj heterogenitet af tumor udviklingsmæssige stimuli. Nylige undersøgelser har faktisk medført en betydelig videnskabelig diskussion om, hvorvidt RMS er af myogene eller ikke-myogene oprindelser, hvilket tyder på, at RMS kan stamme fra forskellige celletyper afhængigt af konteksten12,13, 14 , 15 , 16 , 17. talrige undersøgelser af RMS cellelinjer er blevet udført ansætte tumorsphere formation assay til identifikation af veje involveret i tumor udvikling og karakterisering af markører forbundet med meget selv-fornyelse populationer 18 , 19 , 20 , 21.
Men på trods af tumorsphere formation assay potentiale til at identificere RMS celler af oprindelse, en pålidelig metode, der kan anvendes på primære RMS celler er endnu ikke blevet beskrevet. I denne sammenhæng, en nylig undersøgelse fra vores gruppe ansat en optimeret tumorsphere formation assay til identifikation af RMS celler af oprindelse i en Duchenne muskuløs dystrofi (DMD) musemodel22. Flere præ-tumgenic celletyper, isoleret fra muskelvæv, testes for deres evne til at vokse i lav-fastgørelse betingelser, gør det muligt at identificere muskel stamceller som celler af oprindelse for RMS i dystrofiske kontekster. Beskrevet her er en reproducerbar og pålidelig protokol for tumorsphere formation assay (figur 1), som er blevet anvendt med succes til identifikation af ekstremt sjældne cellepopulationer, der er ansvarlige for mus RMS udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere metoder har været anvendt til isolation og karakterisering af TPCs fra tumor heterogene cellepopulationer: tumor clonogenic assays, FACS isolation, og tumorsphere formation assay. Tumor clonogenic assay blev først beskrevet i 1971, anvendes til stamcelle undersøgelser, og først efterfølgende anvendes til kræft biologi29,30. Denne metode er baseret på kræft stamceller iboende egenskab til at ekspandere uden begrænsninger i bløde gels kulturer<sup c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Ellison Medical Foundation Grant AG-NS-0843-11, og NIH pilot Grant i NIC Cancer Center support Grant P30CA030199 til A.S.
Materials
| Accutase cell dissociation reagent | Gibco | A1110501 | Detach adherent cells and dissociate tumorspheres |
| Celigo | Nexcelom | Celigo | Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells |
| Collagenase, Type II | Life Technologies | 17101015 | Tissue digestion enzyme |
| Dispase II, protease | Life Technologies | 17105041 | Tissue digestion enzyme |
| DMEM high glucose media | Gibco | 11965092 | Component of tumor cells media |
| DMEM/F12 Media | Gibco | 11320033 | Component of tumosphere media |
| EDTA | ThermoFisher | S312500 | Component of FACS buffer |
| EGF recombinant mouse protein | Gibco | PMG8041 | Component of tumosphere media |
| FACSAria II Flow Cytometry | BD Biosciences | 650033 | Fluorescent activated cell sorter |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-11 | Component of tumor cells media |
| Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthetic reagent for animals |
| FxCycle Violet Stain | Life Technologies | F10347 | Discriminate live and dead cells |
| Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | Component of FACS buffer |
| Ham's F10 Media | Life Technologies | 11550043 | Component of FACS buffer |
| Horse Serum | Life Technologies | 16050114 | Component of cell isolation media |
| Lipofectamine 3000 transfection reagent | ThermoFisher | L3000015 | Transfection Reagent |
| Matrigel membrane matrix | Corning | CB40234 | Provides support to trasplanted cells |
| N-2 Supplemtns (100X) | Gibco | 17502048 | Component of tumosphere media |
| Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment | MWI Vet Supply | 701008 | Eyes ointment |
| PBS | Gibco | 10010023 | Component of FACS buffer and used for washing cells |
| pEGFP-C1 | Addgene | 6084-1 | GFP plasmid |
| Penicillin – Streptomyocin | Life Technologies | 15140163 | Component of tumosphere and tumor cells media |
| Recombinant Human βFGF-basic | Peprotech | 10018B | Component of tumosphere media |
| Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein | R&D Systems | 427-FL-005 | Recombinant protein |
| Trypan blue | ThermoFisher | 15250061 | Discriminate live and dead cells |
Riferimenti
- Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
- Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea–a paradigm shift. Ricerca sul cancro. 66 (4), 1883-1890 (2006).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
- Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
- Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
- Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
- Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
- Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
- Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
- Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
- Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
- Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
- Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
- Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
- Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
- Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
- Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
- Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
- Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
- Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
- Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
- Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
- Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
- Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
- Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
- Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Ricerca sul cancro. 31 (12), 2116-2119 (1971).
- Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
- Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
- Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).
